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![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。
2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材
模板DNA、2.5mmol/L dNTP
Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物
10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
PCR儀、移液槍、PCR板
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：
模板DNA 2μL
引物1 1μL
引物2 1μL
dNTP 1.5μL
MgCl2 2μL
10×buffer 2μL
ddH2O 10μL
Taq酶 0.5μL
2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。
3、上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序。
4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測。
附PCR技術(shù)應(yīng)用
1、生命科學(xué) a、人類基因組計(jì)劃 隨著的PCR日臻完善，科學(xué)家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準(zhǔn)確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對(duì)人類基因組基本面貌的首次揭示，表明科學(xué)家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊(yùn)涵的內(nèi)容。 b、后基因組計(jì)劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點(diǎn)。以研究基因功能為核心的“后基因組時(shí)代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及藥物基因組的研究計(jì)劃已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。 c、物種的分類、進(jìn)化及親緣關(guān)系 可以進(jìn)行物種進(jìn)化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。
2、醫(yī)藥 a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾?。喝绲刂泻Ｘ氀?、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均可預(yù)測；癌基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標(biāo)記物來診斷癌癥等疾??；利用基因治療方法治療腫瘤性疾病。 b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括細(xì)菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)高于當(dāng)前的免疫學(xué)方法，所需時(shí)間也已達(dá)到臨床要求，這對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細(xì)菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。 c、DNA指紋、個(gè)體識(shí)別（DNA身份證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用一根頭發(fā)、一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)精子來完成上述工作，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細(xì)胞來大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細(xì)胞生長素等藥物。 e、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥及疾病模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究中的應(yīng)用；利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白,好比在動(dòng)物身上建“藥廠”,可以從動(dòng)物乳汁中源源不斷地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)。
3、農(nóng)業(yè)科學(xué) a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提高產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。 b、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提高畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。
4、考古學(xué)及歷史事件解讀利用人類短串聯(lián)重復(fù)STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學(xué)、人類學(xué)和考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域中。
5、衛(wèi)生安全 a、食品微生物的檢測 傳統(tǒng)的致病菌檢測首先經(jīng)過長時(shí)間的培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準(zhǔn)確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中細(xì)菌指標(biāo)測定。 b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測 目前世界轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人體健康的危害及對(duì)生態(tài)的影響也日受世界廣泛的重視，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。 c、動(dòng)、植物檢疫 靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進(jìn)出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入國門的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染?。ò?、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外，是提高我國綜合國力的必要保證。