動(dòng)物組織中DNA的制備

2016-11-29 16:08 來源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

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關(guān)鍵詞：動(dòng)物動(dòng)物組織 DNA制備

（一）原理

DNA是所有生物體的基本組成物質(zhì)。真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核中。制備DNA時(shí)應(yīng)將細(xì)胞核膜打破方能釋放出來。

細(xì)胞中的DNA和RNA分別與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細(xì)胞破碎后，這兩種核蛋白將混雜在一起。因此，要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脫氧核糖核蛋白的溶解度則最?。▋H約為在純水中的1%）；而在l mol/L NaCl的濃鹽溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在純水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據(jù)這種特性，調(diào)整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此，在細(xì)胞破碎后，用稀鹽溶液，反復(fù)清洗，所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。

分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質(zhì)成分變性，讓DNA游離出來，再用含有異戊醇的氯仿沉淀除去變性蛋白質(zhì)。最后根據(jù)核酸只溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，加入95%的乙醇即可從除去蛋白質(zhì)的溶液中把DNA沉淀出來，獲得產(chǎn)品。

當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸酶（DNase）立即開始降解DNA，如果在破碎細(xì)胞后不及時(shí)采取抑制酶活的措施，最后將會得不到任何DNA。為此，如在本實(shí)驗(yàn)中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2＋離子，使DNase活性降低，并要求整個(gè)分離制備的過程均在4℃以下進(jìn)行，以減少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白質(zhì)（包括DNase）變性。當(dāng)然如果希望獲得更大分子的DNA時(shí)，則在細(xì)胞破碎后，及時(shí)加入SDS使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白質(zhì)成為碎片或氨基酸，及時(shí)阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很長，在水中呈黏稠狀，但DNA鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)不宜小角度的折疊，使之DNA分子具有剛性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折疊和壓擠等剪切力，將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA，操作時(shí)應(yīng)避免急裂振搖，或過大的離心力。轉(zhuǎn)移吸取DNA時(shí)不可用過細(xì)的吸頭，不可猛吸猛放，更不能用細(xì)的吸頭反復(fù)吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠狀，可以用玻璃棒纏起來。液體DNA只要防止DNase污染和高鹽濃度條件下能在液體狀態(tài)保存；抽干后的固體DNA，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。

生物體內(nèi)各部位的DNA是相同的，但取材時(shí)以含量豐富的部位為主，如動(dòng)物的肝臟、脾、腎、血液、精子等。所有材料，必須新鮮及時(shí)使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷凍保存。

DNA的含量及純度可用紫外吸收法、定磷法及化學(xué)法等測定。

（二）試劑及器材

（1） 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0檸檬酸鈉溶液：稱取8.77g NaCl，4.41g檸檬酸三鈉（Na3C6H507 · 2H20），用約800ml蒸餾水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容至1 000ml。

（2） 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液：稱取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于約800ml蒸餾水中，以NaOH調(diào)pH至8.0，最后定容至1 000ml。

（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液：稱取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4）氯仿– 異戊醇溶液：按氯仿:異戊醇=24:1配制。

產(chǎn)品分類

促銷產(chǎn)品

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