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PCR專題：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

2016-08-22 1:22 來源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

PCR技術(shù)可用于：（1）檢驗(yàn)感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)；（2）有效檢測癌基因的突變，準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量
PCR技術(shù)

實(shí)驗(yàn)方法原理
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
 
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；
 
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
 
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
實(shí)驗(yàn)材料
模板DNA
試劑、試劑盒
dNTP Taq DNA聚合酶 蒸餾水 PCR緩沖液 引物 氯化鎂
儀器、耗材
PCR儀 移液槍 PCR板 薄壁管 離心管 離心管盒
實(shí)驗(yàn)步驟

一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系
 

10×擴(kuò)增緩沖液 　   10 ul
4種dNTP混合物 　 各200 umol/L
引物 　　　　 　     各10～100 pmol
模板DNA 　　　 　0.1～2 ug
Taq DNA聚合酶 　  2.5 u
Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L
加雙或三蒸水至 　  100 ul
二、PCR引物設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

1.   引物設(shè)計(jì)的基本原則

（1）  引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。
（4）兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。
（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
（6）引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和C。

（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2.   引物設(shè)計(jì)軟件

Primer Premier5.0 （自動搜索）*、Oligo6 （引物評價(jià)）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在線服務(wù)）。

三、模板的制備

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。

（3）標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

四、PCR反應(yīng)條件的控制

1.  PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 

2.  鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
　　
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
　　
5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
　
6.  反應(yīng)溫度

（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
 
7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增 加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

五、PCR的循環(huán)參數(shù)
 
1.  預(yù)變性（Initial denaturation）

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略

延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.  最后延伸

在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

六、PCR步驟
 
1.  DNA變性

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2.  退火

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.  延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

七、PCR檢測
 
PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物 兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔?，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
展開
注意事項(xiàng)  
其他 一、  PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.  模板核酸的制備。

2.  引物的質(zhì)量與特異性。

3.  酶的質(zhì)量。

4.  PCR循環(huán)條件。

二、 PCR常見問題及對策
 
1.  假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
（1）模板原因

①  模板中含有雜蛋白質(zhì)。

②  模板中含有Taq酶抑制劑。

③  模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

④  在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。

⑤  模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
（2）酶失活

①  需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

②  忘加Taq酶或溴乙錠。
（3）引物

①  引物質(zhì)量。

②  引物的濃度。

③  兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策：

①  選定一個好的引物合成單 位。

②  引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

③  引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④  引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（4）Mg2+濃度

①  濃度過高降低PCR擴(kuò)增的特異性。

②  濃度過低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
（5）反應(yīng)體積的改變

①  通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定;

②  在做小體積如20 ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
 
①  變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。

②  退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

③  擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。
（7）靶序列變異

①  靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列。
 
2.  假陽性，出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
 
（1）引物設(shè)計(jì)不合適

①  選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性。

②  靶序列太短或引物太短。
（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

①  整個基因組或大片段的交叉污染。

解決方案：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

②  空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。

解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3.  出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

（1）  引物與靶序列不完全互補(bǔ)或引物聚合形成二聚體。

（2） Mg2+離子濃度過高。

（3） 退火溫度過低。
（4） PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。

（5） 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
4.  出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
 
（1）原因

①  酶量過多。

②  酶的質(zhì)量差。

③  dNTP濃度過高。
 
④  Mg2+濃度過高。

⑤  退火溫度過低。

⑥  循環(huán)次數(shù)過多引起。

（2）對策

① 減少酶量。

②  調(diào)換另一來源的酶。

③  減少dNTP的濃度。

④  適當(dāng)降低Mg2+濃度。

⑤  增加模板量。

⑥  減少循環(huán)次數(shù)。
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