免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)服務(wù)

   免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)服務(wù)

   免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)是檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用 的經(jīng)典方法, 其基本原理是以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，將靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行共孵育，促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成；隨后加入能夠與抗體Fc段結(jié)合的prorein A/G(預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖小珠上)，形成“結(jié)合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗體-proteinA/G小珠”復(fù)合物，純化該復(fù)合物后凝膠電泳分離蛋白，應(yīng)用 Western blot 或者質(zhì)譜技術(shù)鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。

與其它研究方法相比，免疫共沉淀最大的優(yōu)勢(shì)在于該體系是在生理?xiàng)l件下檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此，不僅可以檢測(cè)到體內(nèi)形成的天然復(fù)合體，而 且可排除過(guò)表達(dá)靶蛋白所帶來(lái)的假陽(yáng)性。其次內(nèi)源性的靶蛋白質(zhì)是完全加工、修飾和成熟的蛋白質(zhì)，因此，依賴(lài)于修飾的蛋白質(zhì)相互作用也能被檢測(cè)到。



 一 原理：

IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。

實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。

其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。

再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。