瓊脂糖凝膠電泳的操作流程分享

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA－－片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA－－片段。
 

操作流程

準備干凈的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。

選擇電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。

正確選擇凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2％之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

適合的電泳緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

電泳的合適電壓和溫度

電泳時電壓不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

DNA樣品的純度和狀態(tài)

是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保/證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號弱甚**缺失。Yuanmu生物DNA分子量標準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA－－片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。Yuanmu公司的DNA Marker條帶清晰，亮度均勻，質(zhì)量穩(wěn)定。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。

凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，雖然毒性小，但價格昂貴。Yuanmu的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。

步驟如下：

1. 制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml): 稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次**瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液.

2. 膠板制備:取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子.將內(nèi)槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直**凝膠完/全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中.添加1×TAE電泳緩沖液**沒過膠板1-2㎜為止.

3. 加樣:在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X.用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi),每加完一個樣品,應(yīng)更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面.(注意:加樣要先記下加樣的順序).

4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,電壓60-100V,樣品由負(黑色)向正(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳.

(5)電泳完畢后,取出凝膠,用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE溶液染色約20 min,再用清水漂洗10 min.

(6)觀察照相:在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存.