流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用詳解

　　研究實(shí)驗(yàn)中，我們常常用到一個(gè)高大上的儀器――流式細(xì)胞儀，而與之相對(duì)應(yīng)的就是流式細(xì)胞術(shù)，可是大家對(duì)它們都了解多少呢？今天遠(yuǎn)慕就帶著大家好好地認(rèn)識(shí)一下。
　　
　　流式細(xì)胞術(shù)
　　
　　流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。其特點(diǎn)是:第一，只要樣本制備成單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒懸液均可以分析。第二，測(cè)量速度快，每秒中可以測(cè)量數(shù)千個(gè)乃至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。第三，同時(shí)測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的多參數(shù)特征。第四，在進(jìn)行細(xì)胞特征分析的同時(shí)可以把指定特征的細(xì)胞分離出來(lái)，以便對(duì)特定細(xì)胞做進(jìn)一步培養(yǎng)、克隆化、觀察或進(jìn)行某些實(shí)驗(yàn)，這就是分選技術(shù)。
　　
　　那么，具體是如何通過(guò)FCM實(shí)現(xiàn)分選的呢？
　　
　　1、首先，制備單細(xì)胞懸液
　　
　　將待測(cè)細(xì)胞或微粒制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，在恒定氣體的壓力下進(jìn)入流動(dòng)室，不含細(xì)胞或微粒的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓柱形的液流束，待測(cè)細(xì)胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。
　　
　　2、其次，收集單細(xì)胞上的熒光信號(hào)
　　
　　流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，細(xì)胞或微粒上的熒光染料被激發(fā)，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。
　　
　　3、再次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果
　　
　　熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原強(qiáng)度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換變?yōu)榭杀挥?jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)把所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)上。
　　
　　4、最后，做細(xì)胞分選
　　
　　細(xì)胞的分選是指根據(jù)所測(cè)定的各個(gè)參數(shù)將指定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來(lái)的一種方式，通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴實(shí)現(xiàn)。在流動(dòng)室的噴口上方配有一個(gè)超高頻的壓電晶體，產(chǎn)生的振動(dòng)使噴出的液流形成均勻的液滴，待測(cè)細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。
　　
　　流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)用了現(xiàn)代多科高技術(shù)，能夠同時(shí)定量檢測(cè)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)指示，顯示出無(wú)比優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)研究、海洋生物以及分選應(yīng)用等研究領(lǐng)域。
　　
　　這么高級(jí)的單細(xì)胞統(tǒng)計(jì)儀器，到底能做哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/strong>
　　
　　比如，細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)記可以幫助分析細(xì)胞，我們以此為例說(shuō)明流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。
　　
　　如圖，一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示熒光散射，將細(xì)胞分散開；橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，結(jié)合的抗體越多，表達(dá)的NKp46越多，說(shuō)明該表達(dá)Nkp46的細(xì)胞群為NK細(xì)胞。結(jié)果顯示： 在C57BL/6小鼠的脾臟和血液中均可檢測(cè)到NKp46的表達(dá)；在B-NDG小鼠中未檢測(cè)到NKp46的表達(dá)，表明B-NDG小鼠中沒(méi)有NK細(xì)胞。
　　
　　T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的檢測(cè)
　　
　　取BALB/c、NOD-scid和B-NDG小鼠的外周血細(xì)胞，并通過(guò)流式對(duì)比其中T 、B和NK細(xì)胞的組成（A）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比（B）。圖3A橫坐標(biāo)/縱坐標(biāo)都表示熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，抗體表達(dá)量越多，則表達(dá)這些marker的相應(yīng)細(xì)胞存在。B-NDG小鼠CD3、CD19和NKp46的相對(duì)應(yīng)區(qū)域沒(méi)有熒光，說(shuō)明B-NDG小鼠中表達(dá)CD3、CD19和NKp46的成熟T,B和NK細(xì)胞不存在。結(jié)果：B-NDG?小鼠外周血中缺乏成熟的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。