抗酸染色詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)

抗酸染色的基本原理：
分枝桿菌的植物細(xì)胞內(nèi)帶有很多的脂類，包圍著在肽聚糖的外邊，因此分枝桿菌一般不容易上色，要?dú)v經(jīng)加溫和增加上色時(shí)間來促進(jìn)其上色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染劑融合后，就難以被酸堿性脫色劑褪色，故稱抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加溫標(biāo)準(zhǔn)下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅堅(jiān)固融合成一氧化氮合酶，用鹽酸乙醇解決都不褪色。當(dāng)再加偏堿美蘭復(fù)染后，分枝桿菌依然為鮮紅色，而別的病菌及情況中的物質(zhì)為深藍(lán)色。

制片：
（1）涂片：左手持菌液試管，右手持接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中取一環(huán)菌，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標(biāo)記圓圈）即可，或先滴一小滴無菌水于載玻片中央，用接種環(huán)從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層。 拔或塞試管塞時(shí)，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。
（2）干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
（3）固定：常用高溫進(jìn)行固定。即手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速來回移動3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色。

染色：
（1）初染：滴加石炭酸復(fù)紅溶液2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。
（2）脫色：
（3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用

油鏡觀察:
1、油不要滴太多
2、在調(diào)節(jié)焦距的時(shí)候要特別注意與載玻片之間的距離不要弄壞工具
3、調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)該從下往上調(diào)節(jié)
4、在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。
5、用左眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。
如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍→油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。
6、油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。

結(jié)果判定:
1.干燥后油鏡觀察300個(gè)視野（觀察時(shí)間不少于4min），抗酸性細(xì)菌呈紅色，其它細(xì)菌或細(xì)胞呈藍(lán)色
2. 報(bào)告方式
2.1 未找到抗酸桿菌
2.2 找到抗酸桿菌±：可疑，發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-2條/300視野
2.3 找到抗酸桿菌1+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌3-9條/100視野
2.4 找到抗酸桿菌2+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-9條/10視野
2.5 找到抗酸桿菌3+:發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-9條/1視野
2.6 找到抗酸桿菌4+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌≥10條/1視野

質(zhì)量控制：
每次用卡介苗做陽性對照
大腸埃希菌ATCC25922做陰性對照

注意事項(xiàng)：
1.每一玻片只能涂一份標(biāo)本，以防脫落混淆
2. 脫色時(shí)間需根據(jù)涂片厚薄而定，厚片可適當(dāng)延長，以無紅色脫出為止
3. 冬季室溫過低時(shí)，染色時(shí)間要適當(dāng)延長
4. 有時(shí)同一個(gè)抗菌體上紅色深淺也有不同，觀察時(shí)應(yīng)注意
5. 每次試劑用完后，請迅速蓋好，以免揮發(fā)，儲存時(shí)應(yīng)避免高、低溫及陽光照射
6. 在涂抹痰標(biāo)本時(shí)，嚴(yán)禁對玻片加熱
7. 染色時(shí)勿使玻片上的染液干燥