單、多克隆抗體及抗原的選擇方法

多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細(xì)胞克隆，產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。

一、單多抗優(yōu)缺點

多克隆抗體優(yōu)點

1.多克隆抗體有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號；

2.能識別多個表位；

3.比單克隆抗體更能容許抗原中的微小變化；

4.識別出與免疫原蛋白質(zhì)具有高同源性的蛋白質(zhì)，或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白；

5.多克隆抗體通常是檢測變性蛋白質(zhì)的首選；

6.多表位通?？商峁└鼮橛辛Φ臋z測。

多克隆抗體缺點

1.易于產(chǎn)生批次間差異；

2.產(chǎn)生大量非特異性抗體，有時可能在某些應(yīng)用中產(chǎn)生背景信號；

3.不適用于探測抗原的特定結(jié)構(gòu)域，因為抗血清通?？勺R別多個結(jié)構(gòu)域。

單克隆抗體優(yōu)點

1.雜交瘤制得后，就成為了恒定的再生源，所有批次都將相同；

2.切片和細(xì)胞染色造成的背景較低。

3.具有特異性，適于分析測定中的一抗或檢測組織中的抗原，并且通常所產(chǎn)生的背景染色顯著低。

4.同質(zhì)性非常高；

5.單克隆抗體的特異性能使其在混合物中和抗原高效地結(jié)合。

單克隆抗體缺點

1.可產(chǎn)生大量特異性抗體，但可能特異性過強；

2.經(jīng)過抗原的化學(xué)處理后比多克隆抗體更易于丟失表位。這可通過使用同一抗原的兩個或多個單克隆抗體進(jìn)行補償。

二、單抗和多抗的選擇

如果對抗體的特異性要求高，用量較大或需要長期使用一致的抗體，制備的抗體應(yīng)用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以選擇制備單克隆抗體。

多克隆抗體的特異性較差，即使是使用相同的抗原制備多抗，不同批次間也會存在差異，因而在特異性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫檢測時，更容易造成背景，例如在WB 中有雜帶，在IHC 中背景較深等等。雖然還存在著交叉反應(yīng)的問題，但由于多抗識別多個抗原表位，即使是有少數(shù)幾個抗原表位被破壞或者抗原構(gòu)象改變，實驗的結(jié)果也不會受到影響。另外多抗需要免疫原的量大，如果免疫原制備困難，建議制備單抗。

若對抗體的特異性要求不高，需要做沉淀和凝集反應(yīng)的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測，可以選擇制備多克隆抗體。

多抗相比較單抗仍然有制備時間短、首次制備成本低的特點，在一些情況下也是一種選擇。另外，在相同條件下，使用多抗可以提高檢測的靈敏度，對于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。

三、抗原的選擇

抗原的選擇可以是天然蛋白、重組可溶蛋白、重組變性蛋白和多肽，抗原質(zhì)量越高，最終制備高質(zhì)量抗體的幾率也會越大！ 目前抗體制備常采用重組蛋白或多肽作為抗原。

常規(guī)情況下，重組蛋白作為抗原往往含有更多的抗原決定簇，既有空間表位，也會有線形序列表位，對于機體的免疫刺激也會相對充分一些，那么最終獲取應(yīng)用面較廣的抗體幾率也會大很多，尤其是目的蛋白已證明有修飾或者復(fù)雜結(jié)構(gòu)的，一般都會優(yōu)先選擇重組蛋白。

當(dāng)然也有必須用多肽制備的，比如對同源家族某一個蛋白抗體的制備，同源性非常高的，需要找到特異性aa合成多肽，再或者一些修飾化抗體，需要在多肽合成階段定點修飾某些AA來制備抗體。

抗原多肽選擇一般遵循如下基本原則

1.盡可能是在蛋白表面；

2.保證該段序列不形成α-helix；

3.N，C端的肽段比中間的肽段更好；

4.避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列；

5.避免同源性太強的肽段；

6.交聯(lián)可以交聯(lián)在N，C兩端，選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端；

7.序列中不能有太多的Pro，但有一兩個Pro有好處，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定一些，對產(chǎn)生特異性抗體有益。