熒光定量PCR體系各種加樣問題解答

PCR反應(yīng)體系中,各試劑加樣量是如何確定的，DNA模板怎么提取，PCR體系。這個(gè)小小管子里都有什么東西、需要加多少呢？今天一起來看一下關(guān)于PCR體系的加樣各種問題。
關(guān)于體系

PCR技術(shù)問世于上世紀(jì)80年代。問世之初的PCR體系比較大，動(dòng)輒以毫升計(jì)?，F(xiàn)在的PCR體系要精巧多了，總體積可大可小。我們常接觸到的常規(guī)PCR以及熒光定量PCR的體系一般都在幾十微升，小到可以10微升左右。

早期的PCR體系，里面的組分都是各自獨(dú)立加樣的，包括DNA模板、上游引物、下游引物、dNTP、Buffer、MgCl2、聚合酶、水。所以早年間做一管PCR需要加樣7——8次才能加完一管。現(xiàn)在就簡化多了。除了特異的 DNA模板與引物以外，其他幾種成分可以做到混在一起，做為PCR Mix統(tǒng)一加樣。這樣每個(gè)管一般只需做4次加樣操作即可完成，工作量減少近一半。

DNA模板來源

DNA模板一般來自于從組織中提取的DNA、或者從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。很多經(jīng)驗(yàn)表明，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA一般要稀釋10倍再做熒光定量PCR，這樣得到的CT值會(huì)在一個(gè)比較理想的范圍內(nèi)。當(dāng)然這并不是固定的做法，還要根據(jù)你的實(shí)際情況來做調(diào)整。用于PCR的引物濃度，比較常用的是10 p mol/ul、等于10 uM。注意單位哦。

PCR mix

PCR Mix由于已經(jīng)是現(xiàn)成的，所以你不必調(diào)節(jié)里面的組分。放心，組分肯定是夠用的。因?yàn)樵谝粋€(gè)PCR體系內(nèi)，引物和dNTP、酶等都是足量甚至過量的。當(dāng)然PCR Mix并不是簡單的把那幾種成分一古腦混在一起就行的，里面還需要特殊成分以維持其穩(wěn)定性。對于熒光定量PCR用的Mix，里面還會(huì)預(yù)混有熒光染料。

dna

如果你對DNA聚合酶有特殊要求，不想簡單的采用PCR Mix，那么你可以單獨(dú)選擇你要的那種酶，以及相應(yīng)的其他組分相配合。

關(guān)于體系中的水

水是用于補(bǔ)齊總體積的。PCR由于成分多、各成分又有不同體積，所以加起來的總體積可能并不剛好是理論上的總體積。計(jì)算總體積一般要參考其中的Buffer的體積。如果是10 x Buffer，那么總體積就應(yīng)該是10 x Buffer體積的10倍。如果達(dá)不到這么多，就加水補(bǔ)齊。如果PCR Mix以及模板和引物的總體積是剛好的，就可不必加水了。

早年的PCR體系往往還要加另一種成分：液體石蠟油。在PCR總體系配制完成后，最后再在上面加一層液體石蠟油。液體石蠟油比較輕，會(huì)漂浮在上面，可防止體系中的水分揮發(fā)。這是一種簡單但很實(shí)用的做法?，F(xiàn)在的PCR管密封很好，又有完善的熱蓋系統(tǒng)，所以這種做法現(xiàn)在已經(jīng)不太常見了。