人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)ELISA試劑盒說明書

人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)ELISA試劑盒應用：用于人血清、血漿或其他相關生物液體中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1的測定。

實驗原理：
本試劑盒采用的是雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附檢測技術（ELISA）。測定樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1水平。向預先包被了抗人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1抗體的酶標孔中，加入標準品和樣本，溫育后，加入生物素標記的抗基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1抗體。再與HRP標記的鏈霉親和素結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入顯色底物TMB，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。最后，在450 nm處測定反應孔樣品吸光度（OD）值，樣本中的人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1的濃度。
 
自備材料
1)蒸餾水。
2)加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3)振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法
1)血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2)血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3)細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4)組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5)保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1)標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。
2)洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1)使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2)根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。
3)加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4)甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5)每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6)甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7)每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8)取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
9)在450nm波長處測定各孔的OD值。

局限
6號標準品以上的結果為非線性的,根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結果。

安全性
1)避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2)實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3)不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

性能
1. 靈敏度:最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結果判斷與分析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的待測物質(zhì)標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。