免疫組化實驗沒有任何著色的解決辦法

良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無色片（即無陽性信號）和“雜音”染色片（有陽性信號）。 一、無色片

染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規(guī)工作中比較常見的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：

1、真陰性結(jié)果：整個染色過程沒有出現(xiàn)問題，組織或細(xì)胞確實不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。

2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：

（1）切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是選擇錯了切片、抗體或蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。

（2）染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結(jié)束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現(xiàn)任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因。

解決陰性染色的問題非常簡單，就是設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達(dá)，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應(yīng)一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內(nèi)部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時最好選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實際工作中需要設(shè)立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題，目前國內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續(xù)切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數(shù)常用的抗體。

二、“雜音”染色片

免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色?！半s音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說明，以下將其歸納為下面幾種。

1、全片著色

全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時間過長。

（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。

（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4度冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。

（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

2、切片邊緣著色

切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：

（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。

（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。

3、“陰陽臉”著色

指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。

4、灶片狀著色

切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問題的原因有：

（1）裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。

（2）壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。

（3）制作APES膠片時，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2% APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37 度過夜干燥、室溫儲存?zhèn)溆?。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時可適當(dāng)加入一些丙酮。

5、間質(zhì)著色

著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時，做甲狀腺球蛋白染色也會出現(xiàn)間質(zhì)著色?？贵w不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們曾遇到CD20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。

6、細(xì)胞漿著色

胞漿著色是所有“雜音”染色中最具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無著色，看上去與真實的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過氧化氫酶（肝、腎），這些可用過氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色最具有欺騙性，因為它廣泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露，內(nèi)源性生物素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+）到強陽性（+++），內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物素暴露的強弱與修復(fù)液有關(guān)，其強度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測系統(tǒng)Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干擾。

7、細(xì)胞核著色

不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲/苯里浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時間太長、組織變干、微波修復(fù)液的pH值和修復(fù)時間不當(dāng)或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作。

其他常見問題：

1、脫片產(chǎn)生的原因有哪些？

（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。

（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

（3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。

（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

（5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

（7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

2、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？（尤其是微波修復(fù)）

關(guān)于抗原修復(fù)，我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù)，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實驗結(jié)果來看，微波修復(fù)其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產(chǎn)生的氣泡所引起，而微波修復(fù)水加熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修復(fù)時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋上蓋玻片，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為：2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調(diào)PH值至6.0，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試，時間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。對于檸檬酸修復(fù)來說，只要高壓修復(fù)時間控制在加閥冒氣后90秒，冷水下終止開高壓鍋蓋，高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子，而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點；關(guān)于EDTA熱修復(fù)，一般說明書上都講的是PH值等于9，實際上我試過，如果單傳用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以，PH也等于9。

3、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關(guān)系，可能原因有：

（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

（2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

（3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。