單克隆抗體制備原理與詳細過程

單克隆抗體制備的原理：

B淋巴細胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力、B細胞的這種能力和量是有限的,不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的、將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體.這種技術即稱為單克隆抗體技術。

單克隆抗體制備的過程：

免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

細胞融合

采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。

選擇性培養(yǎng)

選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。

(1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。

單克隆抗體制備的意義：

用于以下各種生命科學實驗并具有醫(yī)用價值

(1)沉淀反應：Precipitation reaction

(2)凝集實驗：haemaglutination

(3)放射免疫學方法檢測免疫復合物

(4) 流式細胞儀：用于細胞的分型和細胞分離.

(5)ELISA 等免疫學檢測

(6)BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力 .

(7)免疫印記(western blotting)

(8) 免疫沉淀：

(9) 親和層析：分離蛋白質(zhì)

(10) 磁珠分離細胞

(11)臨床疾病的診斷和治療;