人前列腺特異性抗原(PSA)ELISA試劑盒應用方法

人前列腺特異性抗原(PSA)ELISA試劑盒 檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人前列腺特異性抗原（PSA）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人前列腺特異性抗原（PSA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品
酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項
試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
預處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成
名稱    96孔配置    48孔配置    備注
微孔酶標板    12孔×8條    12孔×4條    無
標準品    0.3mL    0.3mL    無
樣本稀釋液    6mL    3mL    無
檢測抗體-HRP    10mL    5mL    無
20×洗滌緩沖液    25mL    15mL    按說明書進行稀釋
底物A    6mL    3mL    無
底物B    6mL    3mL    無
終止液    6mL    3mL    無
封板膜    2張    2張    無
說明書    1份    1份    無
自封袋    1個    1個    無
注：標準品濃度依次為：3200、1600、800、400、200、0pg/mL.

試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法
手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能
準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900。
靈敏度：低檢測濃度小于10pg/mL。
特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%。
貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
有效期：6個月

免責聲明
試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。
嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。