人游離前列腺特異性抗原(fPSA) ELISA試劑盒實驗步驟

一、游離前列腺特異性抗原(fPSA) ELISA試劑盒實驗原理
本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗FPSA單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的FPSA與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗FPSA抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物TMB,出現(xiàn)藍色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測OD值，F(xiàn)PSA濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中FPSA濃度。
 
二、試劑盒組份
組份    48T    96T
酶標(biāo)板(已包被抗FPSA)    48 孔    96 孔
樣品稀釋液    5 mL    5mL
第一抗體工作液    2.7ml    5.5ml
酶標(biāo)抗體工作液    5.5ml    10.5ml
底物液    1 瓶    2 瓶
終止液    3ml    6ml
洗滌液(20×)    25 mL    50 mL
標(biāo)準(zhǔn)品（凍干粉，2000pg/ml）    1 管    2 管
坐標(biāo)紙    1 張    1 張
封板紙    1 張    1 張

三、試劑盒以外自備儀器和試劑
1、標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前每管中加入蒸餾水 400ul 溶解后即可。
2、洗滌液：用重蒸水 1:20 稀釋。

四、注意事項
1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待查樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 底物液使用前建議先行檢查，若溶液顏色發(fā)藍則已失效，棄去。
3. 本試劑盒取出的試劑在室溫條件下使用，溶液應(yīng)輕輕搖勻后使用。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制。
4. 本試劑盒含 2M 硫酸，不要將它與含疊氮化鈉的廢物混在一起。
5. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
6. 不同批號的試劑盒組分不能混用。
7. 正確拿酶標(biāo)板：不要接觸板的底部，否則會影響度數(shù)。

五、操作方法
1. 實驗前 20 分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫（20-25℃）；
2. 取出所需數(shù)量的板條，其余密封放回 4℃；
3. 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔 8 孔，每孔中各加入樣品稀釋液 100ul，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品 100nl，混勻后用加樣器吸出 100ul，移至第二孔。如此反復(fù)對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出 100ul 棄去，使之體積均為 100ul。第八孔為空白對照；
4. 加樣：待測品孔中每孔加入待測樣品 100ul；
5. 將反應(yīng)板置 37℃120 分鐘；
6. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌 4-6 次，向濾紙上印干;
7. 每孔中加入第一抗體工作液 50ul;
8. 將反應(yīng)板充分混勻后置 37℃60 分鐘。
9. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌 4-6 次，向濾紙上印干;
10. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液 100uL. 11. 將反應(yīng)板置 37℃60 分鐘。
12. 洗板：同前。
13. 每孔加入底物液 100uL，置 37℃暗處反應(yīng) 5-10 分鐘。
14. 每孔加入 50uL 終止液混勻。
15. 在 450nm 處測吸光值。（應(yīng)盡快，時間過長可能導(dǎo)致本底偏高）

結(jié)果計算與判斷：
1.所有 OD 值都應(yīng)減除空白值后再計算；
2.以標(biāo)準(zhǔn)品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml 之 OD 值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將濃度作為 X 軸（對數(shù)軸），OD 值作為 Y 軸（線性軸）。曲線應(yīng)為一光滑曲線。
3.根據(jù)樣品 OD 值在該曲線圖上查出相應(yīng)fPSA含量。

六、樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復(fù)凍融。
1、血清：用干凈試管收集血液，室溫凝固 30 分鐘，離心 1000×g15 分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
2、血漿：采用 EDTA 抗凝，抽血后 30 分鐘內(nèi)離心 1000×g15 分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
3、細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液：離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

七、性能參數(shù)
產(chǎn)品名稱：人游離前列腺特異性抗原(fPSA) ELISA試劑盒
簡稱：fPSA試劑盒
規(guī)格：96T/48T
檢測范圍：78.125-5000pg/mL
檢測限：25.4pg/mL
重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)＜10%
板間變異系數(shù)＜15%