PCR反應(yīng)的核心成份——DNA聚合酶的選擇

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)于常年狂奔在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人來(lái)說(shuō)并不陌生。那么，對(duì)于PCR反應(yīng)的核心成份，DNA聚合酶，你選對(duì)了嗎？

常見(jiàn)的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根據(jù)耐熱性來(lái)分可分為耐熱酶和常溫酶。耐熱聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常溫聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根據(jù)保真度來(lái)分，高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等，普通聚合酶 Taq 等。

DNA聚合酶的功能

1）通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng)，使DNA鏈沿5’→3’方向延長(zhǎng)（DNA聚合酶活性）[1]

2）催化由3’端水解DNA鏈（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除錯(cuò)配的堿基）[1]

3）催化由5’端水解DNA鏈（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1]

4）催化由3’端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解

5）催化無(wú)機(jī)焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷酸三磷酸之間的焦磷酸基的交換

面對(duì)如此之多的選擇，大多數(shù)剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新生們默默表示，選擇恐懼癥犯了……那么，解決的方法是，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的 DNA 聚合酶。比如：常規(guī)的 PCR 擴(kuò)增和菌液鑒定，長(zhǎng)度小于 5kb 的片段，保真度要求不高，使用 Taq 酶擴(kuò)增即可。選用 Mix 的形式，混樣更加簡(jiǎn)單，操作更加便捷。如果混樣泡沫多，想滅掉泡沫的話(huà)，推薦大家使用 Green Taq Mix。想要獲得較高的產(chǎn)量，可以選擇 Taq Plus DNA 聚合酶，相對(duì)于 Taq 酶擴(kuò)增性能更強(qiáng)。

1. 選擇熱啟動(dòng)酶降低非特異性擴(kuò)增

在使用 Taq 酶進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，可能的原因可以從模板、引物、體系、程序中一一排查。如模板是否被污染，引物特異性如何，Mg2+濃度偏高等等，其中一個(gè)不可忽視的原因是 DNA 聚合酶的種類(lèi)是否合適。如果排查了其它原因仍舊有非特異性產(chǎn)物，可以選擇熱啟動(dòng)酶重新實(shí)驗(yàn)，即可有效減少或消除體系中其它產(chǎn)物的積累。常用的熱啟動(dòng)酶分為兩類(lèi)：一類(lèi)是化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)酶，如 Ace Taq ，預(yù)變性 95℃5 - 10 min 即可釋放酶活；一類(lèi)是抗體法修飾的熱啟動(dòng)酶，如 Champagne Taq ，預(yù)變性 95℃30s 即可釋放酶活。使用時(shí)注意預(yù)變性時(shí)間，方能獲得滿(mǎn)意的擴(kuò)增效果。

2. 選擇 Lamp 擴(kuò)增長(zhǎng)片段

大于 5Kb 的長(zhǎng)片段又該如何擴(kuò)增呢？如果實(shí)驗(yàn)對(duì)保真度的需求不高，那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍，可擴(kuò)增超過(guò) 20Kb 的基因組、cDNA 片段，對(duì)于低拷貝、低純度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。

3. 選擇高保真酶快速高效擴(kuò)增

如果實(shí)驗(yàn)對(duì)保真度要求較高，在選擇 DNA 聚合酶的時(shí)候就需要使用高保真酶，如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。前三者都屬于第一代高保真酶，已在市場(chǎng)中廣泛使用。諾唯贊科研團(tuán)隊(duì)的大力改造生產(chǎn)的 Phanta 系列的高保真酶，保真度達(dá)到了 Taq 酶的 50 倍，擴(kuò)增性能、擴(kuò)增長(zhǎng)度、產(chǎn)量、模板適應(yīng)性都顯著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍，Pfu 的 6 倍，對(duì)于質(zhì)粒等簡(jiǎn)單模板有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 40kb，cDNA 有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 10kb，基因組有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 20kb，適合于各種 GC 含量的擴(kuò)增，可用于多種樣本的直接 PCR 如植物葉片、全血等。且擴(kuò)增僅需 30s/kb，甚至于 2kb/s。如此卓越，愛(ài)不釋手了吧？

4. 選擇直接擴(kuò)增試劑盒對(duì)粗品擴(kuò)增

xxx生產(chǎn)的各種直擴(kuò)試劑盒，直接對(duì)粗品進(jìn)行擴(kuò)增，大大減少了實(shí)驗(yàn)的工作周期。如小鼠基因型鑒定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit，全血擴(kuò)增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。