大腸桿菌重組蛋白表達系統(tǒng)解答

大腸桿菌（E.coli）重組蛋白表達技術經過多年的發(fā)展，相對于其他表達體系，算是非常成熟的一個體系。大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)主要有以下特點：遺傳背景清楚；易于培養(yǎng)和控制；轉化操作簡單；表達水平高；成本低；周期短。本篇將對大腸桿菌重組蛋白表達系統(tǒng)的常見技術問題進行一一解答。
1、大腸桿菌表達體系的優(yōu)點是什么？

（1）菌體繁殖速度快：20分鐘倍增一次，這意味著按照1/100的比例接種（MOI），只需要幾個小時培養(yǎng)基細菌即可到達穩(wěn)定期；

（2）容易實現高密度培養(yǎng)：理論培養(yǎng)密度是1 × 1013 cells/ml，實際培養(yǎng)過程中使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)大腸桿菌，<1 × 1010 cells/ml。在低溫（11℃）誘導蛋白表達時，細菌個數幾乎不增長。

（3）轉染外源DNA容易，質粒轉染效率高。

2、選擇什么樣的質粒體系？

目前最為常用的重組蛋白表達質粒載體融合了復制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標簽(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白移出策略(fusion tag removal strategy)。

復制子：包含復制起始點及相關順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇合適的質粒載體時，質粒拷貝數應當是需要考慮的一個重要參數。幾個常用的載體系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個菌體中通常含有15-60 copies，通過改造pET載體，可以獲得雙表達質粒（BiPlasmid vector），該質粒含有雙MCS位點，雙T7啟動子，雙lac操縱子和雙核糖體結合位點；pUC系列含有一個突變版本的pMB1起始子，在該系列的載體在單個細菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達體系，如FRET系統(tǒng)，該系列含有p15A起始子，單個細胞含有10-12個copies；pSC101系列載體單個細胞中的拷貝數通常<5個，常被用于三種蛋白的共表達。

啟動子：重組蛋白大腸桿菌表達體系中，lac啟動子是最為常用的啟動子之一。當培養(yǎng)基中只存在乳糖（lactose）作為wei一碳源時，lac啟動子被激活，開始重組蛋白表達。常用帶T7啟動系統(tǒng)的pET系列載體表達目的蛋白，當含有T7啟動系統(tǒng)的質粒轉染進入細菌后，挑取單克隆，培養(yǎng)并加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一種非水解性的乳糖類似物）誘導細菌表達重組蛋白。為了消除重組蛋白本底表達，可以在原先的pET系列質粒載體基礎上加入T7溶酶體與T7 RNAP（RNA polymerase）共表達，T7溶酶體能夠結合T7 RNA聚合酶并限制T7啟動子介導的起始轉錄。

親和標簽：重組蛋白表達過程中采用親和標簽一方面是為了使蛋白純化過程更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。蛋白標簽可分兩類：一類是短肽類標簽；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達。長肽類標簽更多的作用是促進蛋白可溶性，往往需要同時加入短肽標簽以幫助蛋白純化；短肽類標簽一般只含幾個氨基酸，分子量均<2 kDa，對重組蛋白的性質影響較小。親和標簽可以放置在蛋白的C-端和N-端，如需要表達分泌性蛋白，則放置于C-端，信號肽放置于N-端。不同的蛋白標簽需要根據具體需求進行選擇。

3、去除蛋白標簽的方法有哪些？

去除蛋白標簽的方法分為兩類，一類是酶消化法；一類是化學裂解法。化學裂解法通常被用于融合伴侶蛋白的移除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽，該方法優(yōu)點是價格便宜，缺點是蛋白序列中不能存在Met氨基酸殘基。酶消化法是目前最為常用的蛋白標簽去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標簽，只殘留少數幾個氨基酸殘基。帶有His標簽的TEV蛋白酶逐漸被廣泛接受用于蛋白標簽移除實驗，該蛋白酶具有一個非常優(yōu)秀的特點:切除標簽后，只殘留一個Ser或Gly殘基或完全不殘留氨基酸殘基。

4、什么是合適的蛋白表達宿主？

重組蛋白原核表達常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達宿主。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質蛋白。同時BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變，菌株失去甲基化和降解外源轉染質粒的能力，使得質粒能夠傳代保留至子代細菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）。K-12系列菌株具有兩大優(yōu)點：一個是能夠促進胞質中蛋白二硫鍵的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變；另外一個是recA基因突變，改基因突變后外源質粒在宿主菌種中得以穩(wěn)定存在。

5、大腸桿菌表達體系為什么會出現無或低蛋白表達的結果？

誘導前后蛋白存在毒性或者表達過程中密碼子有偏向性，都可能造成蛋白不表達或低表達的結果。建議從以下幾個方面來解決問題：

1）控制本底表達水平：基于lac-based啟動子表達，加入葡萄糖；選擇以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基；基于T7-based啟動子表達，使用含有T7溶酶體質粒；使用嚴謹控制型質粒，降低拷貝數。

2）控制誘導表達水平：采用可調節(jié)啟動子；采用可控制誘導菌株；降低拷貝數；采用適用毒性蛋白表達菌株；采取分泌性表達策略。

3）優(yōu)化質粒DNA密碼子，以適應宿主密碼子體系使用密碼子調整菌株。

4）增加生物質：嘗試新培養(yǎng)基；改善通氣條件，避免泡沐。

6、為什么會形成包涵體？

重組蛋白體系表達過程中，形成不正確的二硫鍵、進行錯誤的折疊、產生低可溶性蛋白，以及缺少翻譯后修飾這一重要環(huán)節(jié)，都可能形成包涵體?？梢圆扇∫韵虏呗詠斫鉀Q這些問題。

1）使用胞質具有氧化功能的E. coli進行分泌性表達。

2）共表達分子伴侶。

3）補充含有化合物伴侶和共因子的培養(yǎng)基。

4）移除誘導劑，增加新鮮培養(yǎng)基。

5）通過低溫誘導表達或調整誘導劑濃度來降低表達速率。

6）改變融合伴侶蛋白，促進可溶蛋白表達。

7）改變表達宿主，如原核改變成真核表達系統(tǒng)。