人表皮細(xì)胞活化肽因子(CAPF)ELISA試劑盒操作步驟

產(chǎn)品名稱：人表皮細(xì)胞活化肽因子(CAPF)elisa檢測(cè)試劑盒
英文名稱：Human cuticular active peptide factor (CAPF) ELISA Kit
規(guī)格:96T/48T
性狀:液體
存儲(chǔ):4℃保存6個(gè)月
檢測(cè)標(biāo)本:血清,血漿,尿液,胸腹水,腦脊液,細(xì)胞培養(yǎng)上清,組織勻漿等

本試劑盒僅供科研實(shí)驗(yàn)使用！

試劑盒的組成：
1    30 倍濃縮洗滌液    7    終止液
2    酶標(biāo)試劑    8    標(biāo)準(zhǔn)品（480μg/L）
3    顯色劑 A 液    9    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4    顯色劑 B 液    10    說明書
5    樣品稀釋液    11    封板摸
6    酶標(biāo)包被板    12    密封袋

標(biāo)本要求：
1. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2. 不能檢測(cè)含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

自備材料：
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法：
1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項(xiàng)：
l 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
l 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
l 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
l 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
l 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
l 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
l 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

安全性：
1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。
2．實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作步驟：
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度, 再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。