人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)ELISA試劑盒說明書

人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)使用目的：
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)含量。

人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)水平。用純化的人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)，再與HRP標(biāo)記的黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人黏膜地址素細(xì)胞黏附分子(MAdCAM-1)濃度。
 
試劑盒組成：
Reagent    Quantity
酶標(biāo)包被板    12well×8strips
標(biāo)準(zhǔn)品      1600pg/ml    1×0.5ml
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液    1×1.5ml
酶標(biāo)試劑    1×6ml
樣品稀釋液    1×6ml
顯色劑A液    1×6ml
顯色劑B液    1×6ml
終止液    1×6ml
30倍濃縮洗滌液    1×20ml×30flod
說明書    1
封板膜    2
密封袋    1

樣本處理及要求：
1.  血清：室溫血液自然凝固  10-20  分鐘，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇  EDTA  或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合  10-20  分鐘后，離心 20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3.  尿液：用無菌管收集，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.  細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心  20  分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用  PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到  100  萬/ml  左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5.  組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持  2-8℃的溫度。加入一定量的  PBS（PH7.4）  ，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.  標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7.  不能檢測含  NaN3  的樣品，因  NaN3  抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品：其濃度為1600pg/ml(貯液)。先將其稀釋為1600pg/ml（標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度)后，再準(zhǔn)備5個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個EP 管中加入150μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成1600pg/ml，800pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0pg/ml）直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
Tube    0    1    2    3    4    5
pg/ml    1600pg/ml    800pg/ml    400pg/ml    200pg/ml    100pg/ml    50pg/ml
 2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）  、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液  40μ l，然后再加待測樣品  10μ l（樣品最終稀釋度為  5  倍）   。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置  37℃溫育  30  分鐘。
4.  配液：將  20  倍濃縮洗滌液用蒸餾水  20  倍稀釋后備用。
5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置  30  秒后棄去，如此重復(fù)  5  次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑  50μ l，空白孔除外。
7.  溫育：操作同  3。
8.  洗滌：操作同  5。
9.  顯色：每孔先加入顯色劑  A50μ l，再加入顯色劑  B50μ l，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15  分鐘.
10.  終止：每孔加終止液  50μ l，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）  。
11.  測定：以空白空調(diào)零，450nm  波長依序測量各孔的吸光度（OD  值）  。 測定應(yīng)在加終止液后  15  分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡  15-30  分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本  OD
值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的  OD  值）  ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n  倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）  。
5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．  底物請避光保存。
7．  嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．  本試劑不同批號組分不得混用。

計算：                                        
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD  值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與  OD  值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD  值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)  R  值為  0.990  以上。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于  9%和  11%
3.保存條件及有效期：
a.試劑盒保存：2-8℃。
b.有效期：6  個月