HRP標(biāo)記抗體-簡易過碘酸鈉法介紹

實驗概要

本實驗用簡易過碘酸鈉法進行HRP標(biāo)記抗體。本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合，99%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。

實驗原理

經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

主要試劑

1. 0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉溶于蒸餾水10ml中。

2. 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml；0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml；加蒸餾水至2,000ml。

3. 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸餾水至50ml，再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

4. NaBH4溶液(4mg/ml)：臨用時稱取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中。

5. 其它的試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)記法。

實驗步驟

1. 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

3. 將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。

4. 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。

5. 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃ 2小時。

6. 將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。

7. 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃ 1小時。

8. 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

9. 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。

10. 結(jié)果判定，除標(biāo)記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62