質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化實驗操作步驟

實驗方法原理

轉(zhuǎn)化活性是檢測質(zhì)粒生物活性的重要指標，在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化（transformation）是特指以質(zhì)粒 DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒 DNA（包括人工染色體）導入細胞的過程， 是一種常用的基本實驗技術(shù)。 該過程的關(guān)鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態(tài)，用于轉(zhuǎn)化的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，以防止對導入的外源的切割，用 R- M- 符號表示。 此外，為了便于檢測，受體菌一般應具有可選擇的標記（例如抗生素敏感性、顏色變化等）。 但質(zhì)粒 DNA 能否進入受體細胞則取決于該細胞是否處于感受態(tài)（competence）。所謂感受態(tài)是指受體細胞處于容易吸收外源 DNA 的一種生理狀態(tài)，可通過物理化學的方法誘導形成，也可自然形成（自然感受態(tài)）。 在基因工程技術(shù)中，通常是采用誘導的方法。 大腸桿菌是常用的受體菌，其感受態(tài)一般是通過用 CaCl2 在 0℃ 條件下處理細胞而形成，基本原理是： 細菌處于 0℃ 的 CaCl2 低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒 DNA 形成抗 DNase 的羥基一鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng) 42 ℃ 短時間熱激處理，促進細胞吸收 DNA 復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上便可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。

實驗材料 大腸桿菌PUC18 質(zhì)粒

試劑、試劑盒 LB 液體培養(yǎng)基含（和不含）氨芐靑霉素的 LB 平板LB 培養(yǎng)基CaCl2

儀器、耗材 塑料離心管微量進樣器玻璃涂棒恒溫水浴鍋（37℃42℃）分光光度計臺式高速離心機

實驗步驟

1. 制備感受態(tài)細胞

1.1 將大腸桿菌 HB101 在 LB 瓊脂平板上劃線，37℃ 培養(yǎng) 16～20 h。

1.2 在劃線平板上挑一個單菌落于盛有 20 ml LB 培養(yǎng)基的 250 ml 三角瓶中，37℃ 振蕩培養(yǎng)到細胞的 OD600 值為 0.3～0.5 之間，使細胞處于對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長前期。

1.3 將培養(yǎng)物于冰溶中放置 10 min，然后轉(zhuǎn)移到 2 個 10 ml 預冷的無菌離心管中，4000 r/min，0℃～4℃ 亡離心 10 min。

1.4 棄上清，倒置離心管 1 min， 流盡剩余液體后，置冰溶 10 min。

1.5 分別向二管加入 5 ml 用冰預冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液懸浮細胞， 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的純度至關(guān)重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品，均影響感受態(tài)的形成。

1.6 4000 r/min，0℃～4℃ 離心 10 min 回收菌體， 棄上清。分別向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，重新懸浮細胞，

1.7 按每份 200 ul 分裝細胞于無菌小塑料離心管中，如果不馬上用可加入終濃度為 10％ 的無菌甘油，置 -20℃ 或 -70℃ 存?zhèn)溆谩?br>
制得的感受態(tài)細胞，如果在 4 ℃ 放置 12～24 h， 其轉(zhuǎn)化率可增高 4～6 倍，但 24 h 后，轉(zhuǎn)化率將下降。

以上均嚴格無菌操作。

2. 轉(zhuǎn)化

2.1 加 10 ul 含約 0.5 ug 自制的 pUC18 質(zhì)粒 DNA 到上述制備的 200 ul 感受態(tài)細胞中。 同時設(shè)三組對照：不加質(zhì)粒；不加受體；加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒 DNA。具體操作參照下表進行。

2.2 將每組樣品輕輕混勻后，冰浴 30～40 min， 然后置 42℃ 水浴熱激 3 min， 迅速放回冰浴 1～2 min。

2.3 向每組樣品中加入等體積的 2×LB 培養(yǎng)基，置 37℃ 保溫 1～1.5 h， 讓細菌中的質(zhì)粒表達抗生素抗性蛋白。

2.4 每組各取 100 ul 混合物涂布于含氨芐青霉素（50 ug/ml）的選擇平板上，室溫下放置 20～30 min。

2.5 待菌液被瓊脂吸收后，倒置平板于 37℃ 培養(yǎng) 12～16 h，觀察結(jié)果。