質(zhì)粒提取試劑盒中各溶液配方及作用

提質(zhì)粒是分子生物學中基本，easy的實驗。完全不需要借助大腦，直接照著提取試劑盒中的操作說明傻瓜操作即可（其實應該由機器人在實驗室中操作這些簡單卻耗時的實驗）。盡管操作簡單，提質(zhì)粒卻也是一個比較重要的步驟，提出質(zhì)粒的質(zhì)量和數(shù)量將直接決定著后續(xù)實驗室的成敗。當我們按照試劑盒中操作說明進行操作時，我們會看到P1，P2，N3, PE，EB等不同的溶液（不同試劑盒可能標識不同）。那么大家是否知道每瓶溶液中裝的什么？它們在質(zhì)粒提取過程中的作用又是怎樣的？
質(zhì)粒提取采用的是強堿裂解法（alkaline lysis），那么我們現(xiàn)在來看一下溶液 P1 ， P2， N3, PE, EB都是什么。

溶液1（P1）

組分濃度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖（Glucose）

溶液1的主要作用是將菌體沉淀懸浮起來。25mM Tris-HCl是緩沖溶液，保證反應體系的pH恒定。EDTA是金屬離子螯合劑，10 mM EDTA的作用是與微生物體內(nèi)的金屬離子相互結(jié)合，抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉降的時間。溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶屬于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低溫4oC保存。

溶液2（P2）

組份濃度 250 mM NaOH，1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）

溶液2的主要作用是細胞裂解。溶液1將細胞懸浮后，就需要添加溶液2了，溶液2的作用就是對細胞進行裂解。溶液2只包括兩種成分：氫氧化鈉和SDS。真正起到到細胞裂解作用的是氫氧化鈉，這也是為什么這個方法會被叫做堿裂解法。氫氧化鈉會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化，從而導致細胞的裂解。SDS的作用將在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一個是時間一定不能過長，另一個是不可以劇烈震動離心管。時間過長以及劇烈震動都將導致氫氧化鈉破壞基因組DNA，斷裂的基因組DNA碎片將會與相似大小質(zhì)粒一同被抽提，污染樣品。

溶液3（N3）

組份濃度 3M 醋酸鉀（potassium acetate），5M 醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步加入的強堿以及清除掉蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)的雜質(zhì)。N是neutralized的縮寫。強堿溶液氫氧化鈉長時間與DNA基礎會破壞其結(jié)構(gòu)，因此需要進行中和。中和氫氧化鈉，5 M醋酸就足夠了，為何又要加入醋酸鉀呢？做過質(zhì)粒提取實驗的同學應該記得，在加入溶液N3后，會有大量沉淀出現(xiàn)。這些沉淀其實醋酸鉀與溶液2中的SDS相互作用，反應生成的十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS）。加入溶液N3后，SDS遇到鉀離子，生成PDS不溶于水，會迅速發(fā)生沉淀。

那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白質(zhì)，基因組DNA等雜質(zhì)的呢？道理是，溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)很容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸就會結(jié)合一個SDS分子，二者結(jié)合會形成SDS2多肽復合體，這樣變性蛋白質(zhì)將溶解在溶液中，從而使得多肽鏈更好地與基因組DNA纏繞。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸鹽與變性蛋白質(zhì)結(jié)合成復合體，十二烷基硫酸鉀的沉淀就將變性的蛋白質(zhì)一起沉淀，同時變性的蛋白質(zhì)與基因組DNA纏繞，結(jié)果也大部分被共沉淀了。而高離子濃度的溶液又加速了這一沉淀過程。此外，溶液被中和后變性蛋白質(zhì)表面電荷減少,也可以促進變性蛋白質(zhì)沉淀。

溶液PE （wash buffer）

組分濃度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）， 80 % 乙醇（Ethanol）

Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的鹽離子。試劑盒中都是利用硅膠柱進行DNA提取的。在DNA與硅膠柱吸附后，需要利用Wash buffer清洗掉多余的鹽離子。Wash buffer中含有高濃度的乙醇，由于乙醇會影響后續(xù)的酶切或測序反應，在洗脫DNA前必須要在離心機內(nèi)”空甩”柱子，完全清除掉乙醇。

溶液EB（Elution buffer）

組分濃度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）

EB的作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。Elution buffer中不能含有過高濃度的鹽離子，因為在高鹽環(huán)境中，鹽陽離子會打破硅膠負氧根和水之間的氫鍵，使得整體的硅膠攜帶正電，會吸引攜帶負電的DNA分子。另外，加熱過的洗脫液（<50°C）可以加速DNA從硅膠膜上脫離下來。另外，離心前保持EB緩沖液在膜上停留時間長一些，將更有利于DNA的洗脫。

不同公司的質(zhì)粒提取試劑盒中溶液成分可能有所差異，比如P1中可以去除掉葡萄糖，溶液PE甚至可以直接用水來代替等等。質(zhì)粒提取實驗是分子生物學中的基本且重要的實驗，盡管實驗本身簡單，但其原理還是有些復雜的。只要清楚實驗的原理，當實驗出現(xiàn)問題之時，會能夠更容易找到原因并給予糾正。