核酸分離與純化的原則、操作步驟

　　磁珠提核酸

　　磁珠法純化DNA主要是利用利息交換吸附材料吸附核酸，從而將核酸和蛋白質(zhì)等其細(xì)胞中其他物質(zhì)分離。本文主要概述了核酸分離與純化的原則、核酸分離與純化的步驟、磁珠法純化DNA原理。

　　核酸分離與純化的原則

　　核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。

　　在分離核酸時(shí)應(yīng)遵循以下原則：保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；排除其他分子污染。

　　核酸分離與純化的步驟

　　大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。

　　1. 細(xì)胞裂解：核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來。細(xì)胞裂解可通過機(jī)械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實(shí)現(xiàn)。

　　(1)機(jī)械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分離。

　　(2)化學(xué)作用：在一定pH環(huán)境和變性條件下，細(xì)胞破裂，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100等) 或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而pH環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿（NaOH）或緩沖液 (TE、STE等) 提供。在一定的pH環(huán)境下,表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑（EDTA等）可螯合維持核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+、Ca2+，從而抑制核酸酶的活性，保護(hù)核酸不被降解。

　　(3)酶作用：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶）以使細(xì)胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L) 和去污劑(0.5%SDS或 1%Triton X-100)存在時(shí)仍保留酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中,酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。

　　2.酶處理：在核酸提取過程中,可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解，以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶（DNase和RNase），DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。

　　3.核酸的分離與純化：核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。

　　(1)酚提取/沉淀法：核酸分離的一個(gè)經(jīng)典方法是酚∶氯仿抽提法。細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的,兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻（適用于分離小分子量核酸）或簡(jiǎn)單顛倒混勻（適用于分離高分子量核酸）后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機(jī)溶劑，預(yù)先要用STE緩沖液飽和，因未飽和的酚會(huì)吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)：故在制備酚飽和液時(shí)要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0～5.5，終濃度為0.3M的NaOAc或KOAc后,鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷,在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入2～2.5倍體積的乙醇，經(jīng)一定時(shí)間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機(jī)溶劑（異丙醇、聚乙二醇(等）和鹽類（10.0mol/L醋酸銨、8.0mol/L的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等）。不同的離子對(duì)一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解，在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)予以選擇。經(jīng)離心收集，核酸沉淀用70%的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸。

　　(2)層析法：層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法。因分離和純化同步進(jìn)行,并且有商品試劑盒供應(yīng)，而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化。在一定的離子環(huán)境下,核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些選擇性吸附方法以經(jīng)修飾或包被的磁珠作為固相載體,磁珠可通過磁場(chǎng)分離而無需離心,結(jié)合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,具有質(zhì)量好、產(chǎn)量高、成本低、快速、簡(jiǎn)便、節(jié)省人力以及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。

　　(3)吸附法：玻璃粉或玻璃珠被證實(shí)為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中,核酸可被吸附至玻璃基質(zhì)上,離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進(jìn)DNA與玻璃基質(zhì)的結(jié)合。在該方法中,細(xì)胞在堿性環(huán)境下裂解,裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后,直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,被異丙醇沉淀的質(zhì)粒DNA結(jié)合至玻璃珠,用80%乙醇真空抽洗除去細(xì)胞殘片和蛋白質(zhì)沉淀。最后用含RNase的TE緩沖液洗脫與玻璃珠結(jié)合的DNA，獲得的DNA可直接用于測(cè)序。

　　磁珠法純化DNA原理

　　磁珠法核酸純化技術(shù)采用了納米級(jí)磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。

　　硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一層硅材料，來吸附核酸，其純化原理類型于玻璃奶的純化方式。

　　離心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一層可發(fā)生離心交換的材料(如DEAE，COOH)等，從而達(dá)到吸附核酸目的。不同性質(zhì)的磁珠微珠所對(duì)應(yīng)的純化原理是不一致。使用磁珠法來純化核酸的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，從而可徹底擺脫離心等所需的手工操作流程。

　　使用羧化磁珠同樣可以分離純化質(zhì)粒DNA。該法在細(xì)胞裂解后，離心分離含質(zhì)粒的水相，再加入羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使目的DNA吸附至磁珠,最后磁場(chǎng)分離被吸附的DNA，經(jīng)乙醇洗滌，用TE洗脫，可獲得高產(chǎn)量的適用于毛細(xì)管測(cè)序的模板DNA。