電泳法分離混合蛋白質(zhì)的基本原理

不同的電泳法有不同的原理，下面是其不同的方法和原理。

（一）一般是通過生化方法吧蛋白提取出來，蛋白質(zhì)帶有電荷么，是將混合樣品中的蛋白質(zhì)，其原理是第一向基于蛋白質(zhì) PI 不同用等電聚焦，電泳時的正極與負極都會發(fā)生電解反應，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。

（二）利用溶解度差別

影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、離子強度；3、介電常數(shù)；4、溫度。但在同一的特定外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。

1、等電點沉淀：原理：蛋白質(zhì)處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時，他的溶解度達到最低點。在等電點之上或者之下時，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而互相排斥，阻止了單個分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時的溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當pH被調(diào)到蛋白質(zhì)混合物中其中一種蛋白質(zhì)的等電點時，這種蛋白質(zhì)大部分和全部被沉淀下來，那些等電點高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中。這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然的構(gòu)象，能重新溶解于適當?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。

5、鹽析與鹽溶 ：原理：低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度這種現(xiàn)象稱為鹽溶.鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用卻加強，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就是因為透析除去了鹽類離子，使蛋白質(zhì)分子之間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。當溶液的離子強度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)溶解程度開始下降。當離子強度增加到足夠高時，例如飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)可以從水中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。此時那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水集團接觸并掩蓋他們的水分子成為下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來的疏水基團。蛋白質(zhì)疏水表面進一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。

鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著他的天然構(gòu)象，能再溶解。鹽析的中性鹽以硫酸銨為最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的溫度系數(shù)較低。

3、有機溶劑分級分離法：與水互溶的有機溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下有機溶劑會引起蛋白質(zhì)變性，如果預先將有機溶劑冷卻到-40°C以下，然后在不斷攪拌下逐滴加入有機溶劑，以防局部濃度過高，那么變性可以得到很大程度緩解。蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度也隨溫度、pH和離子強度而變化。在一定溫度、pH和離子強度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑濃度也可以分離純化蛋白質(zhì)。

有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。有機溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。介電常數(shù)的降低將增加兩個相反電荷之間的吸引力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。

水溶性非離子聚合物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水集團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙了蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度明顯的依賴于聚乙二醇的分子量。

4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定溫度范圍內(nèi)，約0~40℃之間，大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。

（三）根據(jù)電荷不同

根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。

1、電泳：在外電場的作用下，帶點顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。

區(qū)帶電泳是由于在支持物上電泳蛋白質(zhì)混合物被分離為若干區(qū)帶。

電泳前用緩沖液浸潤薄膜或濾紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質(zhì)樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個組分分布在不同的區(qū)域，用顯色劑（蛋白質(zhì)可用考馬斯亮藍或氨基黑等染色）顯色后可以顯示出各個組分。

氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點通過支持介質(zhì)間的接觸印跡轉(zhuǎn)移到第二個支持介質(zhì)上，旋轉(zhuǎn)90°，進行第二次電泳。這種方法稱為雙向電泳。

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強度、pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)性。電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶，然后再進行電泳分離。

電泳有三種物理效應：1、樣品的濃度效應；2、凝膠對被分離分子的篩選效應；3、一般電泳分離的電荷效應。

3、毛細管電泳：高效毛細管電泳、毛細管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細管電泳、毛細管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段和核酸以及多種小分子，也可用于手性化合物的分離。

毛細管減少了由于熱效應產(chǎn)生的許多問題，可以提高熱散失，有助于消除由于熱引起的擴散增加而造成的對流和區(qū)帶變寬，因此管中不需要加入穩(wěn)定介質(zhì)即可進行自由流動電泳。

電泳遷移引起溶液中荷電分子向相反電荷的電極移動，雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而電滲作用使溶液向負極流動，而且電滲電流很強，其速度一般比樣品的電泳速率答，因此所有的正、負離子和中性分子都被推向負極。對荷正電分子來說，電泳遷移和電滲流效果是一致的，而且移動最快，最先達到負極。隨著被分離的分子接近負極，它們都將通過紫外檢測器并把信號傳遞給記錄儀。所得結(jié)果是被分離組分的紫外吸收對時間的峰譜。

4、等點聚焦（IEF）分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)（如濃蔗糖溶液）中進行。在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點的梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。

pH梯度制作一般利用兩性電解質(zhì)，它是脂肪族多胺和多羧類的同系物，它們具有相近但不相同的解離常數(shù)和等電點。在外電場作用下，自然形成pH梯度。

5、層析聚焦：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點差異分離蛋白質(zhì)混合物的柱層析方法。

原理：當用特種緩沖液滴洗填充在柱中的特種多緩沖交換劑時，就會在層析柱中自上而下自動的建立起連續(xù)的pH梯度；同時加在柱上端的蛋白質(zhì)樣品也隨多緩沖液的展開按各自的等電點聚焦在相應的pH區(qū)段。并在展開過程中隨pH梯度下移，蛋白質(zhì)混合物的各組分先后從柱中流出，達到分離純化的目的。

6、離子交換層析：

纖維素離子交換劑：適用于大分子的分離，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。有較大的表面積，大分子可以自由通過。洗脫條件溫和，蛋白質(zhì)回收率高

交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：即可以根據(jù)分子的凈電荷數(shù)量，又可以根據(jù)分子的大?。ǚ肿雍Y效應）進行分離。

蛋白質(zhì)對離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此之間相反電荷基團的靜電吸引，而這又和溶液的pH有關(guān)，因為pH決定離子交換劑和蛋白質(zhì)的電離程度。鹽濃度的微小變化就會直接影響它對蛋白質(zhì)電荷吸附容量。因此蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子強度和pH完成，對離子交換劑結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先從層析柱中洗脫出來。

層析洗脫，采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫，也可以采用改變洗脫的鹽濃度或（和）pH的方式洗脫。后一種方式又分為：跳躍式洗脫和漸進式的連續(xù)改變。采取前一種方式洗脫稱為分段洗脫，后一種方式為梯度洗脫。梯度洗脫一般分離效果好，分辨效率高，特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換機，多采用梯度洗脫。

洗脫時，必須控制洗脫體積（與柱床體積相比）和洗脫液的鹽離子濃度和pH。洗脫液體積和鹽濃度變化形式（梯度形式）直接影響層析的分辨率。

通常采用的梯度形式有線性（形），凸形，凹形和復合型四種。

7、SDS-PAGE 全稱十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳

原理：通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也解離為單亞基，處理后的樣品中肽鏈是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。電泳時SDS-蛋白質(zhì)復合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量。所以SDS-PAGE常用來分析蛋白質(zhì)的純度和大致測定蛋白質(zhì)的分子量。

8、離子交換層析：原理：氨基酸分離常用陽離子交換樹脂，樹脂被處理成鈉型，將混合氨基酸上柱，氨基酸主要以陽離子形式存在，在樹脂上與鈉離子發(fā)生交換，而被掛在樹脂上。

（四）利用選擇性吸附劑的純化方法

某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強弱因被吸附物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附過程涉及范德華力相互作用和請見氫鍵非離子吸引。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭等。硅膠適用于分離堿性物質(zhì)，氧化鋁適用于分離酸性物質(zhì)，活性炭是一種非極性吸附劑。一般選擇其極性與待分離的混合物中極性最大組分的極性相當?shù)南疵撘?。因此，如果待分離物含有羥基，則選擇醇類，含羰基則選用丙酮或脂類。烴類如己烷、庚烷和甲苯則用于非極性物質(zhì)的分離。吸附層析可采用薄層或柱方式進行。

1、羥磷灰石層析：用于分離蛋白質(zhì)或核酸。最重要的用途之一就是吧單鏈DNA和雙鏈DNA分開。羥磷灰石對雙鏈DNA親和力很大，一直用羥磷灰石層析能從含RNA和蛋白質(zhì)的細胞提取液中選擇性的出去DNA。

2、疏水作用層析：根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別發(fā)展起來的一種純化技術(shù)。這種差別也用于鹽分級分離。連在支持介質(zhì)上的疏水集團與蛋白質(zhì)表面暴露出來的集團結(jié)合。

由于疏水作用層析要求鹽析化合物如硫酸銨的存在以促進蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)暴露。為使吸附達到最大，可將蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)至等電點附近。洗脫方式包括：逐漸降低離子強度或增加pH的洗脫液，或使用對固定相的親和力以對蛋白質(zhì)更強的置換劑進行置換洗脫。但是某些洗脫條件可引起蛋白質(zhì)變性。

（五）利用對配體的特異生物學親和力的純化方法

親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子進行特有的識別能力，也即生物學親和力，建立起來的一種有效的純化方法。只需要進行一步的處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復雜的混合物中分離出來，并且純度相當高。

基本原理：把待純化的某一蛋白質(zhì)的特意配體通過適當?shù)幕瘜W反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上。一般在配體和多糖載體之間插入一段長度適當?shù)倪B接臂或稱間隔臂，使配體與凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的位阻妨礙待分離的分子與配體結(jié)合。

當?shù)鞍踪|(zhì)混合物加入填有親和介質(zhì)的層析柱時，待純化的某一蛋白質(zhì)則被吸附在含配體的瓊脂糖顆粒表面上而其他的蛋白質(zhì)因?qū)υ撆潴w無特異的結(jié)合部位而不被吸附，他們通過洗滌即可除去，被特異結(jié)合的蛋白質(zhì)可用含游離的相應配體溶液把它從柱上洗脫下來。

凝集素親和層析、免疫親和層析、金屬螯合層析、染料配體層析和共價層析等屬于親和層析。

（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析

高效液相層析（HPLC）：載體的顆粒愈小，則分辨率愈高，但是洗脫液的流速也愈慢。

反相HPLC廣泛用于分離非極性化合物。固定相是非極性的，而流動相是相對極性的。固定相與被分離物只可能有疏水作用，流動相組成的小小變化，例如加入鹽、改變pH或有機溶劑量就能成功的影響分離特性。

快速蛋白質(zhì)液相層析（FPLC）專門用于蛋白質(zhì)分離，是基于反相、親和、排阻、疏水作用、離子交換和等點聚焦層析，能用于分離微量樣品。

蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin—酚試劑法、紫外吸收法、染料結(jié)合法和膠體金測定法。

Folin—酚試劑能定量的與亞銅離子反應，亞銅離子是由蛋白質(zhì)的易氧化成分還原銅離子而產(chǎn)生的。

BCA法，BCA試劑在堿性溶液中與亞銅離子反應生成紫色復合物，該反應比Folin—酚試劑的反應更強。

紫外吸收法：280nm 芳香族化合物的光學效應

考馬斯亮藍結(jié)合法：靈敏度高，檢測為微克

膠體金測定法：靈敏度最高，膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顏色改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，因此可用于蛋白質(zhì)的定量。

測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量通常要用具有高度特異性的生物學方法。具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用他們的酶活性或激素活性來測定含量。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在注入適當動物的血流中時，會產(chǎn)生抗體。利用抗體抗原反應，也可以測定某一特定蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)純度檢測：電泳、沉降、HPLC和溶解度分析

電泳分析有等點聚焦、聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-PAGE、毛細管電泳。純的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH條件下進行電泳時，都將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只呈現(xiàn)一個條帶。

HPLC常用于多肽、蛋白質(zhì)純度的鑒定。純蛋白質(zhì)樣品在HPLC的洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對稱峰。

純的蛋白質(zhì)在一定的溶劑系統(tǒng)中具有恒定的溶解度，而不依賴與存在于溶液中未溶解固體的數(shù)量。用恒濃度法鑒定蛋白質(zhì)純度在理論上是嚴格的，以加入的固體蛋白質(zhì)對溶解的蛋白質(zhì)作圖。如果蛋白質(zhì)制品是純的，那么溶解度曲線只呈現(xiàn)一個折點，在這個折點以前，直線的斜率為1、之后為0。不純的蛋白質(zhì)的溶解度曲線常常呈現(xiàn)2個或者2個以上的折點。

N-末端分析也用于鑒定純度，因為均一的單鏈蛋白質(zhì)樣品中，N端殘基只可能有一種氨基酸。必須指出，采用任何單獨一種方法鑒定所得結(jié)果只能作為蛋白質(zhì)均一性的必要條件而不是充分條件。很少幾個蛋白質(zhì)能夠全部滿足上面的嚴格要求。