標(biāo)準(zhǔn)曲線的正確繪制方法

分析檢測(cè)中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線目的是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)物質(zhì)的含量，所以標(biāo)曲的制定是實(shí)驗(yàn)室工作中必不可少的工作。做標(biāo)準(zhǔn)曲線真的那么簡(jiǎn)單？你所做的標(biāo)曲真的做好了嗎?導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲的原因是啥？RSD值、線性相關(guān)系數(shù)和線性方程如何？線性好與不好分別由于哪些原因造成的？是儀器、標(biāo)液，還是配制的問題？接下來遠(yuǎn)慕生物帶你來找找原因！

前期測(cè)定時(shí)注意：

1、儀器校驗(yàn)好。

2、移取液體體積要精確，保證迅速準(zhǔn)確，盡可能用一根移液管；為減小人為誤差，同一種液體要一個(gè)人操作。

3、保證標(biāo)準(zhǔn)品的純度，所用標(biāo)準(zhǔn)品最好是新打開的，純度較高的固體或溶液，防止污染。

4、容器要保證潔凈。

5、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品理化性質(zhì)注意加樣的先后順序。

6、如果要測(cè)OD值，應(yīng)保證測(cè)前各管液體充分混勻。

7、若還是有某個(gè)點(diǎn)誤差較大，應(yīng)舍棄。

另外：

1.樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。

2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對(duì)于呈s型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。

3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。

4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對(duì)低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn)，但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。

6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng)，但一般來說，相關(guān)系數(shù)r至少要大于0.98，對(duì)于有些實(shí)驗(yàn)，至少要0.99甚至是0.999。

分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所遇問題？

1、單色光純度不夠

問題：標(biāo)準(zhǔn)曲線上端向下彎曲。

措施：光度法中要求在最大吸收峰處測(cè)定吸光度，光度計(jì)的有效譜帶寬度越窄越好，有利于獲得純度高的單色光。

2.比色皿的厚度或光學(xué)性能不一致

如果裝試劑空白液的比色皿較其它比色皿薄或?qū)獾奈蘸头瓷渖僖恍?，則曲線的延線與縱坐標(biāo)相交；反之，與橫坐標(biāo)相交。

3.顯色反應(yīng)和反應(yīng)條件的問題

當(dāng)顯色反應(yīng)的靈敏度不高時(shí)，被測(cè)物低于某一濃度就不能顯色，當(dāng)濃度不同時(shí)，溶液對(duì)光的吸收、散射的程度不同，低濃度段往往彎曲，加上濃度高時(shí)部分膠體顆粒的聚沉，致使測(cè)定的吸光度降低，曲線上端向下彎曲。

4.操作上的原因

問題：褪色反應(yīng)，顯色溶液的顏色不穩(wěn)定、易褪色，若比色時(shí)間超過了穩(wěn)定時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)系列中高濃度溶液顏色減褪，致使曲線上端向下彎曲。

措施：控制好顯色劑的加入時(shí)間，可以每加3份，停3～3min，再加上3份，依次進(jìn)行，以使每支比色管的顯色時(shí)間相近。

5、干擾物質(zhì)的影響

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢了，該如何檢驗(yàn)？

標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)是實(shí)際操作中最大的難點(diǎn)，也是工作中誤區(qū)和爭(zhēng)議最多的話題了！

先來了解下最重要的三大檢驗(yàn)項(xiàng)目：

1.精密度檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度檢驗(yàn)：精密度檢驗(yàn)就是看試驗(yàn)點(diǎn)距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗(yàn)（擬合檢驗(yàn)），需用F檢驗(yàn)，P<0.05作為線性檢驗(yàn)合格的標(biāo)準(zhǔn)。

2.截距檢驗(yàn)

3.斜率檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距檢驗(yàn)和斜率檢驗(yàn)分別考察Y=a+bX中a和b與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，a與0有差別說明有試劑空白或系統(tǒng)誤差，而b若與0沒差別說明儀器的靈敏度根本達(dá)不到分析要求。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)應(yīng)該是線性檢驗(yàn)結(jié)合失擬檢驗(yàn)，以及殘差的正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)合才是統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較完備的。

標(biāo)準(zhǔn)曲線常見問題匯總

問題一：標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加（0,0）點(diǎn)嗎？

答：不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0）很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，如，全血鉛測(cè)定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0），那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。

問題二：標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎？

答：不需要。儀器測(cè)出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實(shí)沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。

問題三：什么時(shí)候用Y=bx和二次曲線呢？

答：標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格（P<0.05）且失擬檢驗(yàn)合格（p>0.05）此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)潔性原則。

問題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號(hào)算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？

答：工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y(cè)量永遠(yuǎn)是不確定度小的測(cè)量。

結(jié)語

要想繪制出合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線、使用好標(biāo)準(zhǔn)曲線，真心不易，必須將以上各個(gè)方面的條件都考慮進(jìn)去，即對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制也實(shí)行質(zhì)量控制，只有這樣, 才能得出理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
 

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