血清IgG的分離制備實驗—鹽析法

實驗原理

IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，簡稱IgG）的主要成分之一，分子量約為15萬~16萬，沉降生活費數(shù)約為7s。IgG是動物和人體血漿的重要成分之一。血漿蛋白質(zhì)的成分多達70余種，要從血漿中分離出IgG，首先要進行盡可能除去其他蛋白質(zhì)成分的粗分離程序，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。

鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”（Salting in）。而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時，蛋白質(zhì)又變得不深而自動析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析‘（Salting out）。這些現(xiàn)象的原理大致是由于蛋白質(zhì)是親水膠體，帶有羧基解離的負電荷或氨基解離的正電荷，其極性基團使分子間相互排斥，同時與水分子形成水膜，這些因素保證蛋白質(zhì)形成溶于水的溶膠狀態(tài)。當(dāng)加入少量鹽時，增多了蛋白質(zhì)分子上的極性基團，因而增大了蛋白質(zhì)在水中溶解度，出現(xiàn)“鹽溶”現(xiàn)象。但當(dāng)鹽濃度增加到一定濃度時，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水膜，容易沉淀出來；另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子相互磁撞時即發(fā)生相互聚集沉淀出來，這樣就出現(xiàn)了“鹽析”現(xiàn)象。由于各種蛋白質(zhì)“鹽析”出來所需的鹽濃度也各異，鹽析所需的最小鹽量稱做鹽析濃度。鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合溶液中的各個成分分步“鹽析”出來，達到分離目的蛋白質(zhì)。

鹽析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸鎂成功地將血清蛋白分成為清蛋白、球蛋白兩部分。自那以后曾使用過硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽來鹽析蛋白質(zhì)，其中運用最廣的是硫酸銨。因為硫酸銨有許多其他鹽所不具備的優(yōu)點，如在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；溶解度大，25℃時能達到4.1mol/L的濃度；溶解度的溫度系數(shù)變化較小，在0~30℃范圍內(nèi)溶解度變化不大，如25℃時飽和溶解度為4.12mol/L，即767g/L，0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L。而且硫酸銨價廉易得，分段效果比其他鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r也不會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。因此，現(xiàn)在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法。

用硫酸銨分級鹽析蛋白質(zhì)時，鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨濃度一般以飽和度來表示。實際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1。鹽析某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100%或1飽和度的百分之幾，即秒為該蛋白鹽析的飽和度。飽和度可以根據(jù)情況用下述兩種方法計算。

1．飽和硫酸銨溶液法 

在蛋白質(zhì)溶液的總體不大，要求達到飽和度在50%以下時，可選用此方法。在已知鹽析出某各蛋白質(zhì)成分所要過到飽和度時，可按下列公式計算出應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的數(shù)量：

式中：V0——蛋白質(zhì)溶液的原始體積；

C2——所要達到硫酸銨飽和度；

C1——原來溶液的硫酸銨飽和度；

V——應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積。

將計算所得體積的飽和硫酸銨溶液加入到混合蛋白質(zhì)溶液中，即可達到鹽析的目的。嚴(yán)格講，混合兩不同溶液時，混合后的總體積并不等于混合前兩種溶液體積之和，而上式中是按相等于計算的，所以會產(chǎn)生誤差。但實驗證明所造成的誤差一般小于20%，故可忽略不計。

2．固體硫酸銨法 

所需達到的飽和度較高，而蛋白質(zhì)溶液的體積又不能再過分增大時，采用直接加入固體硫酸銨的方法。欲達到某到飽和度可按下列公式計算出應(yīng)加入固體硫酸銨的數(shù)量：

X是將1L飽和度為C1溶液提高到飽和度為C2時，需要加入固體硫酸銨的重量（g）。G和A為常數(shù)，數(shù)值與溫度有關(guān)?，F(xiàn)在已將達到各種飽和度所需固體硫酸銨的數(shù)量列成表，使用時不需計算可直接從表中查出。

市售固體硫酸銨中一般殘留有硫酸，所以制備的飽和硫酸銨溶液的PH常在4.5 ~5.5之間，作用之前應(yīng)該用氫氧化銨調(diào)節(jié)，使其PH為7。用固體硫酸銨鹽析時，蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于具有一定緩沖能力的溶液中，并且在加入硫酸銨中還含有一些重金屬離子，用量大時易使蛋白質(zhì)變性，在這種情況下可加入一些EDTA等螯合劑以螯合這些金屬離子。

硫酸銨鹽析法可使蛋白質(zhì)的純度提高約5倍，而且可以除去DNA，RNA等。但鹽析后的蛋白質(zhì)中仍含有一些雜蛋白，所以鹽析產(chǎn)生的產(chǎn)品為粗分離產(chǎn)品需要進一步純化。本實驗中利用離子交換層析法純化。在離子交換層析之前，由于鹽析所得的蛋白質(zhì)中含有大量硫酸銨，將影響離子交換層析。所以，在層析之前需要“脫鹽”。“脫鹽”有凝膠過濾法和透析法，本實驗將采用凝膠過濾法。

操作方法

（1）在1支離心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L，PH7.0 磷酸鹽緩沖液，混勻。用皮頭滴管吸取飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊攪拌于血漿溶液中，使溶液的最終飽和度為20%（應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液多少毫升？），用滴管邊加邊攪拌，是為防止飽和硫酸銨1次性加入或攪拌不均勻造成局部過飽和的現(xiàn)象，使鹽析達不到預(yù)期的飽和度，得不到目的蛋白質(zhì)。攪拌時不要過急以免產(chǎn)生過多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性。加完后應(yīng)在4℃放置15min，使之充分鹽析（蛋白質(zhì)樣品量大時，應(yīng)放置過夜）。然后以3000r/min離心10min。棄去沉淀（沉淀為纖維蛋白原），在上清液中為清蛋白、球蛋白。

（2）量取上清液的體積，置于另一離心管中，用滴管繼續(xù)在上清液中滴加飽和硫酸銨溶液，使溶液的飽和度達到50%（應(yīng)加飽和硫酸銨溶液多少毫升？）。加完后在4℃放15min，以3000r/min離心10min，清蛋白在上清液中，沉淀為球蛋白。棄去上清液，留下沉淀部分。

（3）將所得的沉淀再溶于5ml0.01mol/L，PH7.0磷酸鹽緩沖液中。滴加飽和硫酸銨溶液，使溶液的飽和度達35%（應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液多少毫升？）。加完后4℃放置20min，以3000r/min離心15min，a，b球蛋白在上清液中，沉淀為IgG。棄去上清液，即獲得粗制的IgG沉淀。

為了進一步化，操作（3）可得1~2次。將獲得的粗IgG沉淀溶解于2ml0.0175mol/L，PH6.7磷酸鹽緩沖液中備用。

試劑和器材

（1）飽和硫酸銨溶液：取化學(xué)純（NH4）2SO4800g，加蒸餾水1000ml，不斷攪拌下加熱至50~60℃，并保持數(shù)分鐘，趁熱過濾，濾液在室溫中過夜，有結(jié)晶析出，即達到100%飽和度，作用時用濃NH4OH調(diào)至PH7.0。

（2）0.01mol/L，PH7.0，磷酸鹽緩沖溶液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液61.0ml，0.2 mol/L Na2HPO4溶液39.0ml，混合，用酸度計檢查PH應(yīng)為7.0。取該混合液50ml，加入7.5gNaCl，用蒸餾水1000ml。

（3）0.0175mol/L，PH.7，磷酸鹽緩沖溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml與0.2 mol/L Na2HPO4溶液56.5ml相混合，用酸度計檢查PH應(yīng)為6.7。取該混合液87.5ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。