【細(xì)胞培養(yǎng)】還有誰(shuí)不會(huì)細(xì)胞爬片制備？

細(xì)胞爬片是一種將細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃或塑料表面上，使其附著并擴(kuò)展的技術(shù)。這種技術(shù)可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等。我們?cè)谧雒庖邿晒猓↖F），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測(cè)（TUNEL）時(shí)，免不了要制備細(xì)胞爬片，爬片質(zhì)量完全決定了最后拍照的質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。今天，遠(yuǎn)慕生物就教大家如何制備好的細(xì)胞爬片。
  爬片的準(zhǔn)備

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細(xì)胞爬片（價(jià)格比較昂貴）但是細(xì)胞貼壁牢固，拍出照片效果好；

2.可根據(jù)自己的需要，到染色時(shí)再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；

細(xì)胞爬片（以常用24孔板為例）

1.胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。

2.加細(xì)胞時(shí)，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過程注意無菌操作，玻片是無菌處理的，可以酒精燈外火焰附近做。

3.根據(jù)自己的需要，選擇合適的細(xì)胞密度（細(xì)胞太密影響拍照效果），將計(jì)數(shù)分好的細(xì)胞混勻后鋪到孔中，種入24孔板一個(gè)孔內(nèi)即可。

4.待細(xì)胞貼壁后，可去上清加處理組培養(yǎng)基。

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，小編會(huì)將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的話，將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。

爬片細(xì)胞的固定處理，以下為常用的固定液：

1.冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（此溫度不會(huì)為固體的）細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā)）固定10min。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 室溫固定15-30min后，將表面液體吹干， -20℃保存

3.95％乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點(diǎn)：但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，孵育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。室溫固定15min后，將表面液體吹干，入-20℃保存

4.甲醛

優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，

缺點(diǎn)： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。

我們將以多聚甲醛為例，講講24孔板內(nèi)，細(xì)胞爬片固定步驟：

1.準(zhǔn)備多聚甲醛（PFA）： 4℃冰箱保存。

2.將細(xì)胞從37℃培養(yǎng)箱取出，用預(yù)溫的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，輕輕晃動(dòng)，避免將細(xì)胞沖掉。

3.注意爬片的細(xì)胞面向上，每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可，室溫固定30-40min，避光。

4.固定后，用PBS洗三次。

5.0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min，覆蓋細(xì)胞即可。

6.PBS洗三次。

7.如果是做免疫熒光后續(xù)用3%的BSA，用PBS配置，封閉1h。

8.封閉后，用PBS洗三遍，按比例加入一抗，4℃過夜，若轉(zhuǎn)入熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒，要避光。

9.過夜后，用預(yù)溫的PBS洗細(xì)胞，動(dòng)作輕緩，可多洗一會(huì)兒，可以用慢搖床搖。

10.加入用3%BSA稀釋的二抗，室溫孵育1h，避光。

11.孵育結(jié)束后，避光用PBS洗3次，動(dòng)作輕緩，可以多洗一會(huì)兒。

12.1ug/mL DAPI ，室溫避光，染細(xì)胞核DNA 20min。

13.PBS洗三次。

細(xì)胞爬片封片

1.將載玻片洗好在干凈無塵紙上晾干 。

2.將PBS中的細(xì)胞取出，注意細(xì)胞面朝下，載玻片上滴入亮甲油，或者防防猝滅封片劑，蓋在載玻片上（市面上可以買到封片防猝滅劑）。細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后做固定。根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡TUNEL染色時(shí)就避免洗，凋亡細(xì)胞在洗的過程中可能會(huì)脫落。

3.保存細(xì)胞爬片時(shí)，一般用培養(yǎng)皿或避光濕盒，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照沒有問題的。