WB試驗(yàn)中常用細(xì)胞裂解液及酶抑制劑介紹

1、細(xì)胞裂解液

細(xì)胞裂解液作用：

(1) 利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；

(2) 溶解蛋白；

(3) 蛋白變性使其穩(wěn)定；

(4) 抑制蛋白酶活性。

細(xì)胞裂解成分一般使用的是表面活性劑，常用的有曲拉通X-100（Triton X-100）、脫氧膽（deoxycholate）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40，NP-40）、十二烷基磺酸鈉（SDS）。其中Triton X-100和NP-40為非離子型，deoxycholate和SDS為離子型。不同裂解成分的裂解強(qiáng)度不同，一般來說Triton X-100和SDS的裂解能力較強(qiáng)，deoxycholate和NP-40的裂解效果較為溫和，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選用不同的裂解液。

2、蛋白酶抑制劑

破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。蛋白酶抑制劑（protease inhibitor）從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。各種蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時(shí)應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。

常用的蛋白酶抑制劑和各自作用特點(diǎn)如下：

(1) 苯甲?；酋７≒MSF）：抑制絲氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巰基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；

(2) 乙二胺四乙酸（EDTA）：作為螯合劑可逆抑制金屬蛋白水解酶；

(3) 胃蛋白酶抑制劑（pepstantin）：抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶；

(4) 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）：可逆抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶B；

(5) 胰蛋白酶抑制劑（aprotinin）：競爭性可逆抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；

(6) AEBSF：一種水溶性的絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，其抑制常數(shù)與PMSF和DFP的抑制常數(shù)相似，可以有效抑制胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、纖溶酶（plasmin）、激肽釋放酶（kallikrein）和凝血酶（thrombin）等蛋白酶，作為PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性更低、水溶性和水溶液穩(wěn)定性更好。

(7) 烏苯美司（I Ubenimex，NN，也稱為bestatin）：競爭性，可逆的氨基肽酶抑制劑，對(duì)精氨酰氨基肽酶（氨基肽酶B），白三烯A4水解酶（顯示環(huán)氧化物水解酶和氨基肽酶活性的鋅金屬蛋白酶），丙氨酰氨基肽酶（氨肽酶M /N），亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶（催產(chǎn)素/血管加壓素酶）（白三烯D4水解酶）有抑制作用；

(8) N-（反式-環(huán)氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E64）：半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制劑；

(9) 胃酶抑素A（Pepstatin A）：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制劑。

3、磷酸酶抑制劑

細(xì)胞或組織裂解時(shí)會(huì)釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，從而影響后續(xù)的蛋白檢測(cè)。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)過程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

常見的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制劑如下：

(1) 氟化鈉（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制劑；

(2) 焦磷酸鈉（sodiμm pyrophosphate）：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑；

(3) β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑；

(4) 正釩酸鈉（sodiμm orthovanadate）：堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑：

(5) 鉬酸鈉（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制劑；

(6) 二水酒石酸鈉（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制劑；

(7) 咪唑（imidazole）：堿性磷酸酶可逆抑制劑。