溶菌酶的制備原理和操作方法

實驗概要
本實驗介紹了溶菌酶（lysozyme）的制備及其性質(zhì)測定的原理和操作方法。

實驗原理
溶菌酶（lysozyme）是由弗萊明在1922年發(fā)現(xiàn)的，它是一種有效的抗菌劑，全稱為   1，4-β-N-溶菌酶，又稱作粘肽N-乙?；邗Ｋ饷富虬谫|(zhì)酶。活性中心為天冬氨酸52和谷氨酸35，是一種糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-   乙酰氨基葡萄糖（NAG）與N-乙酰胞壁酸（NAM）間的β-1，4糖苷鍵，相對分子質(zhì)量14700Da，由129氨基酸殘基構(gòu)成，由于其中含有較多堿性氨基酸殘基，所以其等電點高達(dá)10.8左右，最適溫度為50度，最適PH為6～7左右。在280nm的消光系數(shù)為  13.0。該酶活性可被一些金屬離子Cu2 ，F(xiàn)e2 ，Zn2 （10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2 ,Ca2 （10-5～10-3M）、NaCl所激活。

溶菌酶廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，雞蛋(含量約為2%～4%)和哺乳動物的乳汁是溶菌酶的主要來源，目前，溶菌酶仍屬于緊銷的生化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，具有抗感染、消炎、消腫、增強體內(nèi)免疫反應(yīng)等多種藥理作用。

溶菌酶常溫下在中性鹽溶液中具有較高天然活性，在中性條件下溶菌酶帶正電荷，因此在分離制備時，先后采用等電點法，D152型樹脂柱層析法除雜蛋白，再經(jīng)Sephadex  G-50層析柱進一步純化。最后用SDS-PAGE 鑒定為一條帶。采用福林酚法測蛋白含量，分光光度法測定酶活性。

主要試劑
1. 雞蛋清（鮮雞蛋）
2. 底物微球菌粉
3. D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂
4. 固體氯化鈉（NaCl）
5. 固體硫酸銨(NH4)2SO4
6. 固體磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）
7. 固體磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）
8. 固體磷酸鈉（Na3PO4）
9. 乙醇；蒸餾水；甲醇；考馬斯亮藍(lán)；三氯醋酸；丙酮
10. 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品；Sephadex G50
11. N-乙酰葡萄糖胺；硫酸銅；硫酸亞鐵；硫酸鋅；氯化鎂；氯化鈣；氫氧化鈉；鹽酸
12. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑;蛋白含量測定（福林法）試劑
13.聚乙二醇-20000、兩性電解質(zhì)

主要設(shè)備
1. 循環(huán)水式真空泵 HSB-IⅡ
2. 蛋白紫外檢測儀
3. 記錄儀
4. 紫外分光光度計
5. 梯度混合器(500mL);
6. 721型光分光光度計
7. 冰凍離心機
8. 冰箱
9. 透析袋
10. 酸度計
11. 部分收集器
12. 恒流泵
13. 圓盤電泳裝置
14. 恒溫水浴鍋
15. 層析柱(2.6×1250px)(1.6×750px)
16. 布氏漏斗(500mL)
17. 吸濾瓶 (1000mL)
18. G-3砂芯漏斗(500mL)

實驗步驟
1. 蛋清的制備
將4～5個新鮮的雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出（雞蛋清pH 值不得小于8），輕輕攪拌5分鐘，使雞蛋清的稠度均勻，用兩層紗布過濾除去臍帶塊，量體積約為100ml.

2. 雞蛋清粗分離
按過濾好的蛋清量邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用1mol/L HCl調(diào)pH值至7左右，用脫脂棉過濾收濾液。

3. D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析
1) D152樹脂處理：將D152樹脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用1mol/L NaOH攪拌浸泡并攪拌4～8小時，抽濾干NaOH,  用蒸餾水洗至近pH7.5, 抽濾干, 再用1mol/L HCl按上述方法處理樹脂，直到全部轉(zhuǎn)變成氫型，抽濾干HCl ,  用蒸餾水洗致近pH5.5，保持過夜，如果pH之不低于5.0，抽濾干HCl,用2mol/LNaOH處理樹脂使之轉(zhuǎn)變?yōu)殁c型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5  0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡樹脂。

2)  裝柱：取直徑40px，長度為750px的層析柱，自頂部注入經(jīng)處理的上述樹脂懸浮液，關(guān)閉層柱出口，待樹脂沉降后，放出過量的溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉積至15～500px高度即可。于柱子頂部繼續(xù)加入  pH6.5, 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，使流出液pH為6.5為止，關(guān)閉柱子出口，保持液面高出樹脂表面25px左右。

3) 上柱吸附：將上述蛋清溶液仔細(xì)直接加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內(nèi)，流速為1ml/min。

4) 洗脫：用柱平衡液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線開始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，濃度為0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液。

5) 聚乙二醇濃縮：將上述洗脫液合并裝入透析袋內(nèi)，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。當(dāng)濃縮到5mL左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。

6) 透析除鹽：蒸餾水透析除鹽24小時。

4. Sephadex G50分子篩柱層析
1) 裝柱：先將用20%乙醇保存的Sephadex G50抽濾除去乙醇，用 6g/LNaCl溶液攪拌Sephadex  G50數(shù)分鐘，再抽濾，反復(fù)多次直至無醇味為此。(如果Sephadex G50是新的，則按實驗五中的方法處理凝膠)。加入膠體積1/4的6g/L  NaCl溶液，充分?jǐn)嚢?，超聲除去氣泡，裝入玻璃層析柱（1.6×1250px），柱床1125px。
2) 上樣。
3) 洗脫:樣品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脫液洗下柱壁上的樣品，連接恒流泵，使流速為0.5mL /min，用部分收集器收集，每10分鐘一管。
4) 聚乙二醇濃縮：合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮到5mL左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。
5) 透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時。收集透析液，量取體積。

5. 溶菌酶活力測定
1) 酶液配制：準(zhǔn)確稱取溶菌酶樣品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸緩沖液配成1mg/ml的酶液，再將酶液稀釋成50?g/ml。
2) 底物配制：取干菌粉5mg加上述緩沖液少許，在乳缽中（或勻漿器中）研磨2分鐘，傾出，稀釋到15～25ml，此時在光電比色上的吸光度最好在0.5～0.7 范圍內(nèi)。
3) 活力測定：先將酶和底物分別放入25度恒溫水浴預(yù)熱10分鐘，吸取底物懸浮液4mL放入比色杯中，在450nm波長讀出吸光度，此為零時讀數(shù)。然后吸取樣品液0.2mL（相當(dāng)于10?g酶），每隔30s讀1次吸光度，到90s時共計下四個讀數(shù)。
活力單位的定義是：在25℃，pH6.2，波長為450nm時，每分引起吸光度下降0.001為1個活力單位。
酶的活力單位數(shù)=△A450nm/t×0.001
比活力=酶的活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)

6. 蛋白質(zhì)含量的測定
采用Folin-酚試劑法進行測定。

7. 純度檢測
采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。

8. 理化和酶學(xué)性質(zhì)的測定
可根據(jù)酶純化和活力測定的結(jié)果，運用已掌握的生化知識和實驗技能自行設(shè)計方案進行探索研究。

9. 實驗結(jié)果
步驟項目 體積(ml)總蛋白量(mg)總活力單位比活力(單位/mg)回收率(%)
1.制備蛋清
2.溶菌酶分離
3.D152樹脂柱層析
4. Sephadex G50層析