從凍存的細(xì)胞提取RNA操作步驟

從凍存的細(xì)胞提取RNA

1). 將凍存管從液氮或冰箱中取出；

2). 不待細(xì)胞溶解，將Trizol500ul-1ml直接放入凍存管中，此時(shí)Trizol會(huì)凍成冰狀；

3). 將凍存管緩慢融化，并用加樣器吹打混勻；

4). 將細(xì)胞裂解液移至Eppendorf管中，16000′g離心1min，吸出管底絮狀沉淀;

注釋?zhuān)涸摬襟E并非必要，多數(shù)Protocol省略該步驟，但加入該步中能明顯提高RNA的質(zhì)量；注意不能離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則沉淀難以吸出，將200ul黃槍頭尖部切去0.5cm操作；

5). 加入1/5體積的氯仿（約200ul）,上下顛倒2~3min；

6). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕吸出上清至新的Eppendorf管（約700ul ），不要擾動(dòng)中間層或用手指使Eppendorf管變溫；

注釋?zhuān)阂话闱闆r下提取的RNA已經(jīng)足夠，而且在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA的質(zhì)量要遠(yuǎn)較RNA的數(shù)量更重要，一般僅取上清的上1/2左右足矣，這樣可最大限度避免對(duì)于中間蛋白相的擾動(dòng)；

7). 加入等體積異丙醇（約800ul）,充分混勻，冰上靜置15min；

8). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；

9). 加入1ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4℃ 16000′g離心2min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；

10). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上，至可見(jiàn)乙醇完全揮發(fā)；

11). 用100ul 新鮮制備的DEPC處理過(guò)的MilliQ 水溶解RNA，如果溶解不好，-20℃反復(fù)凍融1~2次，4℃ 16000′g離心3min，將上清吸至新的Eppendorf管中；

12). 加入等體積12 M LiCl，-20℃靜置15min；

13). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；

注釋?zhuān)涸摬襟E的目的在于去除小分子降解RNA和鹽分；但可以省略；只有大分子RNA在高濃度LiCl中沉淀，DNA不會(huì)沉淀；

14). 加入1ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4℃ 16000′g離心2min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；

注釋?zhuān)涸摬降哪康脑谟谌コ齃iCl，LiCl溶于乙醇，而RNA不溶于乙醇，利用溶解度分離；

15). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上，至可見(jiàn)乙醇完全揮發(fā)RNA邊緣呈半透明；

16). 用40ul新鮮制備的DEPC處理過(guò)的MilliQ 水溶解RNA；

17). 取出5ul 用于紫外分光光度計(jì)測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳，其余凍存-70℃。

注釋?zhuān)喝绻鸒D260/OD280＜1.8，則加入等體積Trizol，按上述步驟重新提純。