生物素標(biāo)記蛋白操作方法

下面的操作方法可以使約3~5分子的生物素與1分子的蛋白結(jié)合，對(duì)某些蛋白來(lái)說(shuō)，生物素與蛋白的分子比可根據(jù)不同的生物素化要求進(jìn)行調(diào)整。

1.   溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸鹽緩沖液中，并計(jì)算溶解的毫摩爾數(shù)。如果蛋白含有不恰當(dāng)?shù)木彌_液（如Tris或者甘氨酸），可以通過(guò)在PBS中透析或濃縮的方法除去。計(jì)算：蛋白質(zhì)量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白質(zhì)的毫摩爾數(shù)。

2.  在打開(kāi)之前，平衡生物素至室溫。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超純水中，加入足夠量濃度的生物素，一般對(duì)于10 mg/ml 蛋白來(lái)說(shuō)超過(guò)12倍分子數(shù)，對(duì)于2 mg/ml 蛋白溶液應(yīng)超過(guò)20倍，或者該試劑也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中

3.  室溫30分鐘，或冰上放置2小時(shí)。

4.  用30 ml PBS預(yù)洗純化柱，上樣，加入與欲收集量相同的緩沖液，收集0.5 ml 或1 ml 于單獨(dú)的管中。

5.  以280 nm 的吸收值測(cè)定蛋白含量。

6.  生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入疊氮鈉、甘油等保存。

HABA法檢測(cè)生物素標(biāo)記效果

試劑配制：

1.  PBS（100 mM 磷酸鹽，150 mM Nacl pH7.2）

2.  HABA/親和素溶液：10 mg 親和素、600 ul10 mM HABA于19.4 ml 的PBS中，該溶液的A500大約在0.9~1.3之間，溶液于4℃保存可穩(wěn)定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可過(guò)濾后使用。

比色法檢測(cè)生物素/蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量比：

1.  吸取900 ul HABA/親和素溶液于1ml比色杯。

2.  測(cè)定該溶液在500 nm 處的吸收值并記錄為“A500 HABA/Avidin”。

3.  吸取100 ul 生物素標(biāo)記的蛋白于杯中并測(cè)定500 nm 的吸光度值，記為A500 HABA/Avidin/Biotin （數(shù)值必須恒定15s 以上）如果A500 HABA/Avidin/Biotin的值不超過(guò)（≤）0.3，重新稀釋待測(cè)樣品并檢測(cè)。

注：計(jì)算結(jié)果時(shí)必須考慮稀釋度。

4.  計(jì)算Biotin/Protein摩爾比

①A=生物素化的蛋白毫摩爾濃度＝蛋白濃度（mg/ml）/蛋白的分子量

②B=500nm處的吸光度變化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin

③C=生物素的毫摩爾濃度=mmol Biotin/ml反應(yīng)溶液=△A500/（34,000×光程）

④Biotin/Protein摩爾比=C?10?稀釋倍數(shù)/