影響免疫組化的因素及對(duì)策

一）免疫組化染色假陽(yáng)性及其對(duì)策

1、消除內(nèi)源酶的影響在涉及免疫過氧化酶的各種染色中，均用過氧化物酶來標(biāo)記抗體，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，正常組織中也含有一定量的過氧化物酶，其同樣也能催化底物顯色，而影響免疫組化染色的特異性，因此在加入標(biāo)記酶前應(yīng)設(shè)法將其滅活，以保證染色反應(yīng)的特異性。

通常情況下，去除內(nèi)源酶的方法是先用3%的過氧化氫溶液作用，但在含有豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，由于血細(xì)胞中存在大量具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，產(chǎn)生氣泡而破壞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。在OCT包埋的冰凍切片中，使用3%的過氧化氫化溶液亦會(huì)產(chǎn)生類似現(xiàn)象。此時(shí)可用3%的過氧化氫甲醇溶液孵育20分鐘的方法滅活內(nèi)源性酶。

滅活內(nèi)源酶對(duì)正確判斷含血細(xì)胞較多的標(biāo)本，如骨髓、胎盤、脾等的染色結(jié)果十分重要。同樣，正常細(xì)胞也含生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合后繼抗體，形成親和素（或鏈親合素）-生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽(yáng)性發(fā)生。消除這種非特異性著色的方法，是在采用生物素方法染色前，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行親和素處理，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和。

2、抗體導(dǎo)致的非特異性著色高純度、高效價(jià)的抗體是免疫組化染色的關(guān)鍵。出現(xiàn)下列情況時(shí)，可能發(fā)生非特異性著色。

（1）因抗原不純而導(dǎo)致制備的抗體不純，常見于多克隆抗體?？捎糜H和層析的方法除去非特異性抗體或應(yīng)用高純度的抗原制備抗體，采用單克隆抗體能避免非特異著色。

（2）標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇，解決的方法只有采用針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體。

3、消除非特異性背景著色

非特異性著色最常見的情況是蛋白質(zhì)（抗體）吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結(jié)締組織成分上，防止非特異性背景著色的方法之一是在滴加一抗前在標(biāo)本上加一種無關(guān)的蛋白質(zhì)溶液，封閉荷電點(diǎn)不給一抗留有吸附余地，以保證一抗不會(huì)吸附到膠原纖維及結(jié)締組織成分上。最常用的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液是所用二抗的同種動(dòng)物非免疫血清。用產(chǎn)生二抗的同種動(dòng)物血清，是為了避免二抗與預(yù)先加入的蛋白質(zhì)結(jié)合引起假陽(yáng)性染色。

用來阻斷非特異性結(jié)合的血清不能有任何溶血現(xiàn)象。紅細(xì)胞破裂會(huì)使其中的過氧化酶與底物作用，產(chǎn)生非抗原特異性的陽(yáng)性著色。多克隆抗體因其成分復(fù)雜，更易造成背景染色。稀釋液采用含1%BASpH7.4的PBS,同時(shí)在洗液中加入0.05%的吐溫20（Tween20）有助于消除背景染色。

4、消除病理性色素的影響

當(dāng)所檢動(dòng)物由于出血等原因造成吞噬含鐵血黃素細(xì)胞增多時(shí)，為防止其與DAB顯色呈現(xiàn)的黃褐色發(fā)生混淆，最好選用AEC顯色劑。組織固定時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，切片中容易產(chǎn)生福爾馬林色素顆粒，影響結(jié)果觀察，取材時(shí)應(yīng)充分用流水沖洗，以消除影響。

5、切片制作不當(dāng)引起的非特異性著色在嚴(yán)重變性、壞死及炎性病灶處，在膠原纖維和結(jié)締組織部位，在切片裱貼不平、折皺處以及組織邊緣部位常會(huì)出現(xiàn)非特異性著色。其中有的是因組織荷電狀態(tài)改變而吸附抗體；有的機(jī)理不明；有的可能與組織邊緣或皺折深部的槽形構(gòu)型有關(guān)，解決的辦法是在滴加一抗前，以二抗動(dòng)物的正常血清（5%~10%）封閉、飽和電荷吸附位點(diǎn)和改善取材與制片技術(shù)。

6、清洗不充分而造成的非特異性著色應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。緩沖液中含一定量的鹽，其有利于減低背景著色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液內(nèi)加入吐溫20,效果更佳。特殊標(biāo)記時(shí)，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。另外，在清洗后至加入下一步試劑前，不能干片，干片的部位會(huì)出現(xiàn)非特異著色。

7、DBA顯色產(chǎn)生的某些背景顏色使用濃縮型DAB試劑盒時(shí)，請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸鎦水的pH值，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。粉劑DBA溶解時(shí)，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去。否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2.

（二）免疫組化染色的假陰性及其對(duì)策

通常可因標(biāo)本抗原保存，試劑質(zhì)量及染色操作等因素引起假陰性。

1、組織處理不當(dāng)固定不及時(shí)或固定時(shí)間過長(zhǎng)常導(dǎo)致抗原丟失。浸蠟溫度過高，時(shí)間過長(zhǎng)將破壞抗原的抗原性。應(yīng)改善技術(shù)條件，重新取材。

2、抗原修復(fù)由于目前所進(jìn)行的常規(guī)石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲鍵等封閉了部分抗原決定簇，或由于蛋白之間發(fā)交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽，因此在染色時(shí)，有些抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。至于哪種抗原需要進(jìn)行修復(fù)，需在建立染色程序時(shí)經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定?？乖迯?fù)分為化學(xué)方法和物理/化學(xué)方法。

（1）化學(xué)方法：主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根據(jù)需要使用。（2）物理/化學(xué)方法：主要有以下幾種

①單純加熱方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，加熱至沸騰，并持續(xù)10~15分鐘，此方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有實(shí)驗(yàn)室，但對(duì)封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。②高壓加熱方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中，加熱至噴氣，并持續(xù)1~2分鐘。

③微波方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，并持續(xù)10~15分鐘，室溫20~30分鐘自然晾涼，使蛋白復(fù)性。此方法不僅利用熱效應(yīng)，且可通過微波的直接作用，打開蛋白之間的交聯(lián)鍵，將已被封閉的抗原決定簇暴露和修復(fù)。

3、一抗的選用、稀釋度及孵育時(shí)間第一抗體是免疫組化染色中最重要的試劑。應(yīng)用何種一抗，應(yīng)根據(jù)具體目的和要求決定。臨床病原診斷，要求較高的敏感性和較廣的識(shí)別譜時(shí)，可選用多克隆抗體或幾株混合的單克隆抗體，來避免抗體反應(yīng)譜過窄造成的假陰性。某些研究工作需要檢測(cè)單一抗原決定簇的存在，此時(shí)必須選用單克隆抗體。一抗的參考稀釋度常由“方格滴定”和相關(guān)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)得出，但因?qū)嶒?yàn)條件不同，對(duì)抗原活性的影響不同，最佳稀釋度仍需經(jīng)過摸索。任何一個(gè)抗體，其工作稀釋度取決于如下因素：

（1）抗體的滴度即特異性抗體濃度；

（2）抗體的純度，即抗體中雜蛋白的濃度。雜蛋白較高時(shí)，需要較高的稀釋度；（3）孵育的時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，所用的抗體稀釋倍數(shù)越高；

（4）組織中抗原含量對(duì)抗體的應(yīng)用濃度有不同的要求。在免疫反應(yīng)中，過多的抗體將導(dǎo)致陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶現(xiàn)象。因此需用“方格滴定”的方法找出適當(dāng)?shù)南♂尪龋?br>
并得到最大強(qiáng)度的抗原染色和最低的背景著色。一般認(rèn)為，某一稀釋度下特異性染色較強(qiáng)且無背景著色，是較理想的稀釋度，加長(zhǎng)孵育時(shí)間可有效地降低所用抗體的濃度，有利于提高染色質(zhì)量，節(jié)省抗體，可用37℃0.5h或4℃過夜的方法。只要控制好溫度、抗體稀釋度和孵育時(shí)間，一般都能得到理想的染色效果。

4、選擇適宜的二抗二抗應(yīng)用中常出現(xiàn)的總是是抗體本身與一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠來源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔來源的一抗，都會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

5、試劑造成的影響酶的活性降低，緩沖液內(nèi)加有疊氮鈉抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某種試劑等，都會(huì)造成假陰性結(jié)果。如陽(yáng)性對(duì)照不成立，則需認(rèn)真檢查操作程序，查找可能的原因。