瓊脂擴散試驗(單向和雙向)操作步驟

實驗概要

可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴散，二者相遇，在比例合適處形成白色沉淀?；绢愋陀袉蜗驍U散和雙向擴散兩種。本文介紹了單向和雙向兩種瓊脂擴散試驗的操作流程。單向瓊脂擴散試驗主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補體成份的含量；雙向瓊脂擴散試驗可用來分析和鑒定標本中多種抗原或抗體成份，并用以測定抗原或抗體的效價。

實驗原理

1. 單向瓊脂擴散試驗是一種定量試驗，將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔，再將抗原標本加入孔內(nèi)，經(jīng)過一定的時間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴散時間相關(guān)。用不同濃度的抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量即可從準標曲線中求出。

2. 抗原和抗體加到瓊脂板上相對應的孔中，兩者各自向四周擴散，如兩者相對應，濃度比例合適，則經(jīng)一定時間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線。每一抗原與其相對應抗體只能形成一條沉淀線，若同時含有若干對抗原抗體系統(tǒng)，因其擴散速度的不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。且根據(jù)沉淀線融合情況，還可鑒定兩種抗原是完全相同還是部分相同。

實驗步驟

1. 單向瓊脂擴散試驗(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的測定

1) 材料

IgG、IgA、IgM免疫板、參考血清、待檢血清、微量加樣器(10微升)、量尺、紗布、生理鹽水、帶蓋方盤。

2) 方法

a. 免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂(用PH8.2、0.05M的巴比妥緩沖液配成)，加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清(抗血清最終稀釋度取決于抗血清所標化的稀釋度)，混勻，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔，孔徑為3mm，孔距1～1.2cm。

b. 稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用，參考血清、待檢血清稀釋按要求進行。

c. 加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清，每個檢樣加兩個孔，每孔滴加10微升。

d. 擴散：將免疫板置水平濕盤內(nèi)，放進37℃溫箱，IgG免疫板擴散24小時，IgA、IgM板48小時后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，(如果沉淀環(huán)不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時后觀察)，必要時可以染色后觀察。

e. 繪制標準曲線及血清標本中IgG、IgA、IgM定量測定：測量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān)，還與分子量和擴散時間有關(guān)。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系，這種關(guān)系有兩種計算方法：

Mancini曲線－適用于大分子抗原和長時間擴散(＞48小時)的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù))。

Fehey曲線－適用于小分子抗原和較短時間(24小時)擴散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線，濃度的對數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù))。

2. 雙向瓊脂擴散試驗(Double immunodiffusion test)

1) 材料

羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制瓊脂粉，生理鹽水、載玻片，打孔器(直徑3mm)、濕盒、吸管等。

2) 方法

a. 用生理鹽水配制1.0～1.5%瓊脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁熱澆于載玻片上，制成瓊脂板。

b. 待瓊脂凝固后，按右圖用打孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂(孔距為5mm)。

c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。

d. 將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)放置24小時后觀察結(jié)果。