PCR測定支原體實驗步驟

實驗材料： Taq DNA多聚酶引物 陽性對照 DNA脫氧核苷三磷酸 混合物三磷酸 瓊脂糖1.3%TAE膠

試劑、試劑盒： 磷酸緩沖鹽溶液液 Tris醋酸 EDTA6×加樣緩沖液 引物儲備液

儀器、耗材： DNA抽提和純化系統(tǒng)基質(zhì)的DNA抽提試劑盒 熱循環(huán)儀

實驗步驟

一、DNA 標(biāo)本的收集和制備

1. 需要檢測支原體污染的細(xì)胞系，在收集樣品前數(shù)天或至少在解凍后兩周內(nèi)，不能加任何抗生素。應(yīng)保證支原體在培養(yǎng)上清中的效價在 PCR 測定范圍之內(nèi)。

2. 收集 1 ml 貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。這樣收集的標(biāo)本包含活的或死的細(xì)胞，其優(yōu)點是一些支原體會明顯地黏附在真核細(xì)胞上，甚至侵入細(xì)胞中。上清液可貯存在4°C 數(shù)天或 -20°C 數(shù)周。在樣品溶化后，應(yīng)立即操作。

3. 上清液在 13000 g 離心 5 min，將沉淀用 1 ml D-PBSA （D-PBSA （磷酸緩沖鹽溶液液）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.2；121℃，20 min 高壓滅菌）重懸浮，渦旋混勻。

4. 再次離心懸浮液，用 D-PBSA 沖洗一次以上，如步驟3。

5. 離心后的沉淀用 100 μl D-PBSA 重新懸浮，渦旋混勻，然后加熱至90°C，15 min。

6. 在分解細(xì)胞后，采用標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法或其他 DNA 抽提方法立即抽提 DNA 。

二、PCR 反應(yīng)

建立規(guī)則以避免 DNA 加入過多，嚴(yán)格按照以下步驟進(jìn)行：

①DNA 抽提的地方和 PCR 進(jìn)行的地方及 PCR 之后走膠的地方應(yīng)分開；

②所有試劑應(yīng)以最小量分裝以保證能恒定提供無污染的試劑；

③避免重復(fù)擴(kuò)增（reamplification）；

④貯存只用于 PCR 操作的吸量管、吸頭、試管，經(jīng)常用紫外線照射；

⑤連續(xù)進(jìn)行 PCR 操作，應(yīng)嚴(yán)格按以下步驟進(jìn)行；

⑥在樣品制備及 PCR 進(jìn)行的全過程，應(yīng)戴手套操作；

⑦應(yīng)包括相應(yīng)的對照反應(yīng)，內(nèi)對照、陽性對照、陰性對照及水溶液對照。

1. 用以下溶液對每個樣品進(jìn)行二次測定

僅用于樣品：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 緩沖液，9.5 μl 蒸餾水。

用于樣品和內(nèi)對照 DNA：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 緩沖液，8.5 μl 蒸餾水，1 μl 內(nèi)對照 DNA，事先混合后貯存多份樣品，三個樣品用于無內(nèi)對照反應(yīng)（包括陽性、陰性及水溶液反應(yīng)），兩個樣品用于有內(nèi)對照反應(yīng)，包括陽性、陰性對照，總體積要富余一些以彌補(bǔ)吸取過程的損失。

2. 將 14 μl 已混合好各種貯備液加入到 0.2 ml PCR 反應(yīng)管，加入 1 μl 蒸餾水用作水對照反應(yīng)。

3. 制備多聚酶混合液（每個反應(yīng) 10 μl，再加額外 10 μl，以保證吸取足夠量）。每個反應(yīng)中含有 1 份 PCR 緩沖液和 1 單位 Taq 多聚酶。

4. 移去所有用于制備事先混合貯備液的試劑。

5. 取出欲測試 DNA 樣品和陽性對照 DNA ，不要同時處理試劑和樣品。

6. 加 1 μl DNA 制備液至一個不包含內(nèi)對照 DNA 反應(yīng)管內(nèi)，另加 1 μl DNA 制備液至一個包含內(nèi)對照 DNA 反應(yīng)管內(nèi)。

7. 進(jìn)行熱啟動 PCR，將反應(yīng)混合物（未加多聚酶）轉(zhuǎn)移至加熱反應(yīng)器中，依照下面步驟進(jìn)行一個加熱周期；

第一步：95°C，7 min；

第二步：72°C，3 min；

第三步：65°C，2 min；

第四步：72°C，5 min 。

在第二步時，打開加熱器蓋子，加入 10 μl 多聚酶混合液至每個管內(nèi)，如有許多樣品則操作時間可能延長。打開或關(guān)閉反應(yīng)管應(yīng)分開進(jìn)行，以避免樣品的揮發(fā)。在繼續(xù)進(jìn)行下個周期步驟前，在加入 Taq 多聚酶至最后一個反應(yīng)管和關(guān)閉加熱器蓋前至少應(yīng)有 30 s 以平衡溫度以及移去蓋上冷凝物。

8. 在開始笫一個周期后，按照以下參數(shù)進(jìn)行 32 個加熱周期：

笫一步：95°C，4 s；

笫二步：65°C，8S；

笫三步：72°C，16s；

每個周期再另外延 1 s 。

9. 72°C，10 min 完成最后的擴(kuò)增步驟，結(jié)束反應(yīng)，然后將樣品冷卻至室溫。

10. 制備一個含有 0.3 μl 溴化乙啶 /ml 的 1.3% 瓊脂糖-TAE 膠，膠上用 1×TAE （50× TAE（Tris 醋酸 EDTA）： 2 mol/L Tris 基液，5.71% 冰醋酸（V / V），100 mmol/L EDTA，調(diào)節(jié) pH 至 8. 5）覆蓋，每孔加入 12 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物（10 μl 反應(yīng)混合物，2 μl 6× 加樣緩沖液（6× 加樣緩沖液：0.09% （W / V），溴酚藍(lán)，0.09% （W / V）二甲苯藍(lán)FF，60 % 甘油（V / V )，60 mmol/L EDTA）），10 V/cm 開始電泳。

11. 紫外線掃描顯示特異產(chǎn)物，記錄擴(kuò)增結(jié)果。