【遠(yuǎn)慕技術(shù)】BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(BAS-ELISA)是ELISA的一種改良技術(shù)，將BAS，即生物素-親和素系統(tǒng)(biotin avidin system)引入ELISA，大大提高了ELISA的靈敏度。 (一) 親和素和生物素

1. 親和素(avidin) 給動(dòng)物飼喂大量卵白蛋白后，可引起生物素缺乏癥，此后證明，卵白蛋白中存在一種對(duì)生物素有異常親和力的堿性蛋白，稱之為抗生物素蛋白或卵白素，現(xiàn)今均稱為親和素。因?yàn)橛H和素存在于卵白蛋白中，故可從雞蛋白清中提取親和素，它是由四個(gè)相同的亞基組成的堿性糖蛋白，分子量6.6～6.8萬，等電點(diǎn)為10.5，由于每個(gè)亞基都可以結(jié)合一個(gè)生物素分子，所以親和素呈四價(jià)反應(yīng)性，在血清學(xué)反應(yīng)中，可以產(chǎn)生新的放大作用；現(xiàn)規(guī)定凡結(jié)合1μg生物素所需親和素的量，即為親和素的一個(gè)活性單位，1mg純親和素約含13～15個(gè)活性單位。

2. 生物素(biotin) 即維生素H，主要存在于卵黃、腎、肝等組織中，除可提取外，也能人工合成，另外在動(dòng)植物體內(nèi)也廣泛存在，系結(jié)構(gòu)簡單的小分子物質(zhì)，分子量244.31，它不能直接與親和素結(jié)合，需活化后，產(chǎn)生生物素衍生物(即生物素酰羥基丁二酰亞胺，HS，為白色結(jié)晶，熔點(diǎn)200～202℃)才能與親和素結(jié)合。另外，它還能高比度地偶聯(lián)抗體等反應(yīng)物質(zhì)和酶等標(biāo)記材料，分別制成生物素化抗體和生物素化酶等，在免疫反應(yīng)中起到一級(jí)穩(wěn)定的放大作用。

因?yàn)橛H和素對(duì)生物素有極強(qiáng)的特異性結(jié)合作用，且具有多價(jià)性，據(jù)此，可以建立生物素化抗體-親和素-生物素化酶復(fù)合物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測體系，利用親和素為中介，一端通過生物素化抗體聯(lián)接檢測抗原的免疫反應(yīng)系統(tǒng)，另一端通過生物素化酶等連接標(biāo)記顯示系統(tǒng)，可產(chǎn)生多極放大作用，從而明顯地提高了檢測的特異性和敏感性。

(二) BAS-ELISA的技術(shù)類型 該檢測系統(tǒng)可分為以下兩類：

1. BAB法 (biotin-avidin-biotin) 即以游離的親和素分別橋聯(lián)生物素化抗體和生物素化酶的檢測方法。目前最常用的是本法的改良法，即預(yù)先使親和素與生物素化酶形成復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)，再使其與生物素化抗體反應(yīng)，因而叫做ABC法，此法既減少了反應(yīng)步驟，又因ABC網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可網(wǎng)絡(luò)數(shù)量極為可觀的酶分子，從而使BAS的靈敏度又得到了進(jìn)一步的提高。

2. BA法 (Ab-biotin-avidin-HRP)即直接以酶標(biāo)親和素聯(lián)接生物素化抗體，檢測抗原的方法。

為簡化反應(yīng)程序，廠家試制了酶聯(lián)BAS試劑，連接被檢測的免疫反應(yīng)系統(tǒng)是生物素化抗體，即生物素化抗抗體-羊抗兔(SARG-b)和兔抗小鼠(RAMG-b)及一種生物素化抗體-生物素化馬抗人AFp。較常用的生物素化酶是生物素化辣根過氧化物酶(bHRP)。

(三) BAS-ELISA在檢測工作中的應(yīng)用 該技術(shù)應(yīng)用最多的一個(gè)方面是檢測可溶性抗原如細(xì)菌和病毒等，以及它們的相應(yīng)抗體，現(xiàn)舉例如下：

1. 細(xì)菌性抗原的檢測 Yolken等采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測流感桿菌b型、肺炎球菌和鏈球菌抗原等，先用相應(yīng)抗體包被酶標(biāo)板，然后分別加入細(xì)菌培養(yǎng)上清液、生物素化抗體和親和素與生物素化酶復(fù)合物來實(shí)施反應(yīng)；本法檢測的靈敏度比常規(guī)ELISA和熒光抗體法高4～16倍。

2. 病毒性抗原的檢測病毒性抗原也可用雙抗體夾心法檢測，如檢出糞便中的輪狀病毒，可用抗體包板，再相繼加入待檢標(biāo)本、生物素化抗體、親和素和3H標(biāo)記的生物素，然后作放射免疫測定。國內(nèi)已用此法檢測單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、肺炎病毒及其相應(yīng)抗體。