樣品中微生物定量檢驗方法的驗證

微生物定量檢驗一般都涉及菌落計數(shù)。對計數(shù)結果進行數(shù)據(jù)處理時通常需要使用統(tǒng)計的方法。由于菌落計數(shù)服從泊松分布，因此釆用泊松分布的統(tǒng)計方法對計數(shù)結果進行數(shù)據(jù)處理優(yōu)于釆用正態(tài)分布的統(tǒng)計方法。檢驗者往往習慣采用正態(tài)分布的統(tǒng)計方法，因此也可以通過對數(shù)轉換或加1后開方的方法將原始數(shù)據(jù)轉換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)后再進行統(tǒng)計分析。兩種統(tǒng)計方法都適用于微生物數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。 1.準確度

微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與藥典方法檢驗結果一致的程度。準確度的確認應在檢測的范圍內(nèi)，通常用微生物的回收率（%）來表示。

檢測范圍內(nèi)的準確度都應符合要求，準確度驗證的方法是：制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/ml）。例如，菌落計數(shù)平皿法的替代方法，在制備高濃度菌懸液時，其濃度可以是103cfu/ml，并系列稀釋至100cfu/ml。每個試驗菌應至少選擇5個菌濃度進行準確度確認，替代方法的檢驗結果不得少于藥典方法檢驗結果的70%，也可以采用合適的統(tǒng)計學方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當替代方法的回收率高于藥典方法時，有必要結合專屬性項下的有關內(nèi)容對準確度進行評價。

2.精密度

微生物定量檢驗的精密度是指在檢驗范圍內(nèi)，對同一個均勻的樣品多次重復取樣測定，其檢驗結果的一致程度，通常采用標準偏差或相對標準偏差來表示，也可以采用其他適宜的方式。

精密度驗證的方法是：制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/ml）。每個試驗菌選擇其中至少5個濃度的菌懸液進行檢驗。每一個濃度至少應進行10次重復檢驗，以便能夠采用統(tǒng)計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差。一般情況下，可以接受的相對標準偏差（RSD）應不大于35%。不考慮特殊的檢驗結果，替代方法的相對標準偏差（RSD）應不大于藥典方法。

3.專屬性

微生物定量檢驗的專屬性是指通過檢測適宜的試驗菌，以證明檢驗方法與其設定目的相適應的能力。例如，菌落計數(shù)平皿法其設定目的在于檢出一定數(shù)量的微生物，則其專屬性驗證應證明當樣品中存在一定數(shù)量的試驗菌時，通過平皿法檢驗，能夠檢出試驗菌，而樣品的存在不會對結果造成影響。專屬性驗證時，應能夠設計出可能使替代方法出現(xiàn)假陽性的實驗模型來挑戰(zhàn)替代方法，從而確認替代方法的適用性。當替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現(xiàn)混濁就可以定量時（如不需要增菌或在1～50cfu范圍內(nèi)就可直接測定菌數(shù)的定量方法），以上驗證方式就顯得更為重要。

4.定量限

微生物定量檢驗的定量限是指樣品中能被準確定量測定的微生物最低數(shù)量。由于無法得到含有已知微生物數(shù)量的實驗樣品，因此，在定量限驗證時，應選擇在檢驗范圍內(nèi)至少5個菌濃度，每個濃度重復取樣測定不少于5次，替代方法的定量限不得大于藥典方法。需要注意的是，由于細菌計數(shù)和菌落數(shù)服從泊松分布，可能存在計數(shù)結果的誤差，因此替代方法的定量限僅需證實在相近的低限度下其靈敏度至少相當于藥典方法。

定量限驗證的方法是：在檢驗范圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進行不少于5次檢驗，采用統(tǒng)計方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異，從而評價替代方法的定量限。

5.線性

微生物定量檢驗的線性是指在一定范圍內(nèi)，檢驗結果與樣品中微生物數(shù)量成比例關系的程度。線性驗證時必須覆蓋能夠準確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應選擇至少5個濃度，每個濃度至少測定5次。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，以檢驗結果為因變量，以樣品中微生物的預期數(shù)量為自變量進行線性回歸分析，計算相關系數(shù)r。當相關系數(shù)不能準確評估線性時，只能確定簡單大約的關系值。替代方法的相關系數(shù)不得低于0.95。

6.范圍

微生物定量檢驗的范圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，檢驗方法適用的高低限濃度或數(shù)量的區(qū)間。

7.重現(xiàn)性

微生物定量檢驗的重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實驗條件（如實驗地點、實驗人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時，所得檢驗結果的精密度。重現(xiàn)性可視為微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)量的試驗菌（接種量應在定量限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時間，使用不同的試劑（或儀器）進行檢驗，對檢驗結果進行統(tǒng)計分析，以相對標準偏差（RSD）來評價兩種方法的重現(xiàn)性差異。驗證過程中，應關注樣品的一致性。

8.耐用性

微生物定量檢驗的耐用性是指當方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗結果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應在方法中加以說明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應單獨對替代方法的耐用性進行評價，以便使用者了解方法的關鍵操作點。