免疫組化染色之抗原的高壓修復法

免疫組織化學染色是一項廣泛應用于腫瘤病理診斷和神經(jīng)解剖學的技術(shù)，一些生物公司提供的免疫組化染色服務可以把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在組織、細胞甚至亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)。免疫組化染色方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在病理診斷和病理研究領(lǐng)域都起著十分重要的作用。免疫組化染色質(zhì)量受到多方面因素的影響，抗原修復是其影響因素之一，常見的抗原修復技術(shù)方法有高壓修復法和微波加熱修復法。

在染色過程中，用甲醛固定后，在石蠟包埋過程中會使抗原性物質(zhì)或由于形成醛、羧甲基等原因而被封閉了部分抗原決定簇，或由于甲醛固定和石蠟包埋后部分抗原決定簇與核酸或其他蛋白發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)絡。固定液中的醛基在使蛋白質(zhì)變性的同時，自身也會交聯(lián)形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，使組織抗原決定簇封閉，從而影響免疫組織化學結(jié)果。為解決這些問題就需要做抗原修復。而抗原修復技術(shù)的應用，大大提高了免疫組化的染色效果。正確應用抗原修復技術(shù)在免疫組化染色中具有重要的作用。遠慕生物提供免疫組化染色服務。 1、高壓抗原修復法

檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法是一種常見的高壓修復法，適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復，其效果優(yōu)于微波修復法和直接煮沸修復法，使得免疫組化結(jié)果更加可靠。儀器設備為市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑18cm為好)；1000-1500W電爐一臺；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。所需試劑為0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.14.

操作步驟：

（1）常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(800-1500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計時，1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2×3')。

(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。

注意事項：

(1)加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在5-8分鐘為好，時間過長可能會使染色背景加深。

(2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導致掉片。(3)高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。

(4)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lysine。

(5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。

2、高壓修復和微波加熱修復之比較

研究者研究了不同抗原修復方法對食管癌中免疫組化染色結(jié)果的影響。方法是選取Ki67、IL17、CD4和CD8四種分別定位于細胞核、細胞漿與細胞膜的不同抗原做為免疫組化染色的標記，在食管癌連續(xù)切片上應用高壓抗原修復和微波抗原修復進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原高壓修復的染色效果要優(yōu)于微波修復。一方面，CD4抗原高壓修復染色的陽性率要高于微波修復染色的陽性率；另一方面，CD8、Ki-67和IL-17高壓修復染色的陽性率與微波修復染色的陽性率無顯著性差異。因此在組織不易脫片的情況下，優(yōu)先考慮使用抗原高壓修復；在微波修復與高壓修復染色陽性率沒有顯著性差異的情況下，應該盡可能選擇微波修復這種較柔和的方法以避免組織脫片。

抗原修復影響著免疫組化的染色質(zhì)量，不同抗原修復方法影響著實驗結(jié)果的表達，目前高壓加熱法是較為廣泛的一種方法，此法不但可修復變性的抗原，同時還可使組織通透性提高，從而獲得良好的染色效果，但是在操作過程中應特別注意抗原修復液、加熱的溫度和修復時間的選擇。在實際工作中，并非所有的抗原都要進行抗原修復，抗原性保存良好或基本保存者不需要修復，同時應根據(jù)抗原種類予以選擇修復方法，必要時可多種復原方法同時使用，以其獲得更理想的結(jié)果。