【蛋白酶K小知識(shí)】蛋白酶K生產(chǎn)過程中的挑戰(zhàn)

蛋白酶 K(Proteinase K)是一種廣譜絲氨酸蛋白酶,蛋白酶 K于1974年在fungus Engyodontium album的提取物中發(fā)現(xiàn)。能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)作為唯一碳源和氮源的環(huán)境中生長(zhǎng)，說明該酶可以消化角蛋白，因此被稱為“蛋白酶 K”。蛋白酶K由一條肽鏈組成，含有277個(gè)氨基酸，該蛋白的相對(duì)分子量~28.9kDa，蛋白酶K是一種穩(wěn)定且具有高活性的絲氨酸蛋白酶。晶體和分子結(jié)構(gòu)研究證據(jù)表明該酶屬于枯草素家族，具有活性位點(diǎn)催化三聯(lián)體(Asp39-His69-Ser224)。蛋白酶K家族包含了各種由革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母及真菌分泌的細(xì)胞內(nèi)肽酶。

蛋白酶K具有非常穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)、超高的蛋白水解活性以及廣泛的底物特異性，偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈，能優(yōu)先分解與含硫氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的羧基端連接的肽鍵。與其它的蛋白酶相比較，蛋白酶在一系列廣泛的環(huán)境中均穩(wěn)定：pH，緩沖鹽，去污劑（SDS）以及溫度。如：該酶的活力不會(huì)被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制，在高溫、高鹽或較高的pH等條件下，蛋白酶K仍能保持非常高活力。因該酶可以在較廣的pH范圍(4～12.5)內(nèi)及高溫(50～70℃)均有活性，在0.1-0.5% SDS存在的情況下，蛋白酶K可保持活性，在不損害分離DNA完整性的前提下，可以消化DNA制劑中的多種蛋白質(zhì)和核酸酶。
  蛋白酶K /國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):

《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）是2018年5月1日實(shí)施的一項(xiàng)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，歸口于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院。《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）規(guī)定了蛋白酶K產(chǎn)品的術(shù)語和定義、技術(shù)要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸及貯存?！兜鞍酌窴》（GB/T 34793-2017）適用于生化試劑蛋白酶K產(chǎn)品的生產(chǎn)和檢測(cè)。

蛋白酶K生產(chǎn)過程中的挑戰(zhàn)：

①表達(dá)量低：由于蛋白酶K能夠非特異性的降解大多數(shù)蛋白，因此在使用微生物表達(dá)生產(chǎn)該蛋白時(shí)，其表達(dá)的蛋白酶K可以對(duì)表達(dá)宿主中的有功能的蛋白進(jìn)行水解，造成表達(dá)宿主不能持續(xù)的表達(dá)該蛋白，因此蛋白酶K的表達(dá)量很低。而篩選高表達(dá)量蛋白酶K的表達(dá)系統(tǒng)或菌株，需要花費(fèi)大量的精力和較長(zhǎng)的時(shí)間。

②不穩(wěn)定性：雖然蛋白酶K可以在高溫、高鹽或較高的pH等苛刻的條件下保持很高的活性，但是該酶可以自己酶解自己，在無保護(hù)劑時(shí)，在37℃條件下很難長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。

③該酶易沉淀：在制備蛋白酶K的凍干粉時(shí)，為了保證凍干粉中蛋白酶K的固含量維持在一個(gè)比較大的水平，通常需要在高濃度時(shí)加入凍干保護(hù)劑，然而在蛋白酶K濃度達(dá)到20mg/mL或者以上時(shí)，該酶很容易聚集形成沉淀，這給蛋白酶K的高固含量?jī)龈稍斐闪藰O大的挑戰(zhàn)。

④生產(chǎn)投入大：在大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量色素和宿主核酸的殘留，簡(jiǎn)單的純化工藝很難除去這些雜質(zhì)，而使用復(fù)雜的純化工藝則會(huì)降低了回收率并且使生產(chǎn)成本加大。蛋白酶K具有很強(qiáng)的蛋白水解活性，能夠?qū)?shí)驗(yàn)室或車間使用到的其它酶或蛋白水解，所以生產(chǎn)蛋白酶K需要專門的產(chǎn)地、儀器設(shè)備及配套設(shè)施。