DEAE-纖維素提取法純化多克隆抗體

DEAE-纖維素提取法純化多克隆抗體：該法提取IgG簡(jiǎn)便，既可小量提取，也可大量制備。

1．批量提取法 稱取DEAE-纖維素（DE32或DE52）50g，置于1000ml燒杯中，先以蒸餾水漂浮除去細(xì)顆粒，再經(jīng)酸堿處理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液（PB）平衡。將水分抽干，或用布氏濾斗（內(nèi)放兩層濾紙）過(guò)濾，收集濕纖維素，以降低其離子強(qiáng)度。按1ml血清加濕重5g DEAE纖維素，經(jīng)過(guò)充分?jǐn)嚢?，?℃吸附1h。上清液可再如此處理一次，即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡(jiǎn)便，既可小量提取，也可大量制備。

2．Tris-Cl離子交換層析法（Ion-exchange chromatography）

【材料和試劑】
（1）DE32或DE52纖維素。
（2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
（3）待純化標(biāo)本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
（4）1.5×50cm 層析柱；透析袋；紫外分光光度計(jì)及其他透析和層析所需的試劑和器材。

【操作步驟】
（1）DE52纖維素的處理：DE52經(jīng)酸、堿處理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
（2）裝柱：將層析柱固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出口接一細(xì)塑料管并關(guān)閉出水。將浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高時(shí)，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松開(kāi)出水口螺旋夾，控制流速1～2ml/min，同時(shí)連續(xù)加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片。
（3）平衡：松開(kāi)出水口螺旋夾，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速為15滴/min，待流出液與洗脫液之pH值達(dá)到一致時(shí)，停止平衡。
（4）待提取樣品的準(zhǔn)備：將蛋白裝入透析袋里，置4℃冰箱，對(duì)0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析過(guò)夜。
（5）加樣、洗脫與收集：用吸管吸去柱面液體，以毛細(xì)吸管沿柱壁加入樣品，樣品體積相當(dāng)于柱床體積的1％～2％，蛋白濃度為50～70mg。啟開(kāi)出水口螺旋夾使樣品緩慢進(jìn)入柱床內(nèi)，并用少量洗脫液清洗柱壁；待液體進(jìn)入柱床后，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脫，控制流速為14～16滴/min。分部收集器收集，紫外監(jiān)測(cè)，或人工收集，以紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管280nm OD值，描繪洗脫液峰。
（6）濃縮：將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合并，裝入透析袋，以PEG濃縮至所需體積。

3．Tris-PO4離子交換層析法
該法在上述方法的基礎(chǔ)上稍加改良，即通過(guò)梯度洗脫，可用于血清中IgG和IgM的提取。

【材料和試劑】
（1）DE32或DE52纖維素。
（2）待純化標(biāo)本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
（3）1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
（4）梯度洗脫液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4；.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4。

【操作步驟】
（1）蛋白標(biāo)本對(duì)0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4透析。
（2）DE52裝柱，并以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4平衡。
（3）加樣，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4洗脫，紫外監(jiān)測(cè)直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。
（4）以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4洗脫，這一步驟可用于純化血清IgG和IgM。 
（5）以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4梯度洗脫，總量收集250ml；重復(fù)步驟（5）。
（6）根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰，透析濃縮和保存同上。
用過(guò)的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性，加入0.02％疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/div>

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