流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)處理樣本步驟

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）能夠快速測(cè)定細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，并可以對(duì)特定的細(xì)胞進(jìn)行分選收集。廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。接下來(lái)的 Protocol 中以小鼠的淋巴細(xì)胞為例進(jìn)行細(xì)胞表面和胞內(nèi)染色。

一. 試劑準(zhǔn)備（遠(yuǎn)慕提供各種實(shí)驗(yàn)試劑）
Wash Buffer：PBS+1% FBS
破膜劑（ICS）：用雙蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。
破膜固定劑：將配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀釋 100 倍
ICS Wash Buffer：將配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀釋 100 倍。

二. 細(xì)胞表面染色
收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入適量 Wash Buffer 液洗滌，1500 rpm 離心 5 min，去上清，加入 50 μl Wash Buffer 重懸。
（可選）Live dead 染色，每管加 0.1 μL Zombie GreenTM Dye（樣品多時(shí)使用時(shí)可先稀釋），震蕩混勻，室溫避光孵育 10～15 min。Wash Buffer 液洗滌，1 500 rpm 離心 5 min，棄上清。
封閉 Fc 受體：每管中加入 1 μg/106 細(xì)胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗體封閉熒光抗體 Fc 受體引起的非特異性染色。震蕩混勻，4℃ 孵育 30 min（或室溫避光 15 min）。Wash Buffer 液洗滌，1 500 rpm，離心 5 min，棄上清。
用適量體積 Wash Buffer 液重懸每個(gè)樣本，將各組細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)混合后分裝到單染管和不染抗體管，作為流式檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)電壓。
單染管中加入相應(yīng)表面染色抗體，同時(shí)在每個(gè)樣本中加入 1 μL percp CD3/106 細(xì)胞和 0.5 μL PE CD4/106 細(xì)胞，震蕩混勻，4℃ 避光孵育 30 min（或室溫避光 15 min）。
用 Wash Buffer 液洗滌，1500 rpm 離心 5 min，棄上清。
打孔或者加入 200 μL 1% PFA（多聚甲醛）固定過(guò)夜。

三. 胞內(nèi)染色
將全部管細(xì)胞固定打孔。每管加入 150 μL 固定破膜劑，震蕩混勻，4℃ 避光孵育 20 min。
ICS Wash Buffer 液洗滌，用法同 Wash Buffer 液。
在相應(yīng)的需要進(jìn)行胞內(nèi)染色的樣本中加入適當(dāng)量胞內(nèi)染色抗體（如 APC IFN-γ抗體），4℃ 孵育 30 min 或室溫避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗滌，1 500 rpm 離心 5 min。
棄離心上清液，根據(jù)實(shí)際情況加入 200 μL 或者 300 μL Wash Buffer 液重懸。
震蕩混勻，流式上機(jī)。

四. 注意事項(xiàng)
每一步離心倒掉上清時(shí)可以先在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪幾層平板紙，傾倒上清后可吸掉管口的液體。
為了避免打孔劑對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響從而影響后續(xù)圈門影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以不管是否需要胞內(nèi)染色，每個(gè)樣本都需要打孔。
染色時(shí)抗體的加入量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，為避免抗體濃度對(duì)染色的影響，樣品染色體系不得大于 100 μL。為減少染色時(shí)加樣的誤差，可配置表面染色抗體稀釋液，雙染或多色染色可把多種抗體稀釋到一管中。按 10 μL 或 5 μL 體系，用 Wash Buffer 液稀釋。
為了避免游離抗體的結(jié)合出現(xiàn)假陽(yáng)性，可洗滌兩次。
檢測(cè)的細(xì)胞量不能過(guò)少也不能過(guò)多，細(xì)胞太少檢測(cè)時(shí)樣本流量會(huì)增大影響變異系數(shù)，細(xì)胞過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致抗體或染料相對(duì)不足，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。