免疫熒光操作步驟（漂片，冰凍切片）

實(shí)驗(yàn)概要

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將腦片放到，6 孔板（或 12 孔板），按照二抗說(shuō)明書(shū)，加 3%雙氧水封閉 10min（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用 PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差別）；

2. 吸去雙氧水，PBS 洗兩遍，將腦片周?chē)乃梦埢蛐l(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；

3. 然后按照一抗說(shuō)明書(shū)，將一抗按比例稀釋?zhuān)尤胂♂尯蟮囊豢?，一般，大鼠腦片一張需 50 微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30 微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；

4. 然后，4℃，過(guò)夜（18h 或者 24h），不建議使用 37℃；

5. 然后，PBS 洗凈兩遍；剩下步驟見(jiàn)二抗試劑盒說(shuō)明書(shū)。

6. DAB 配方為：10mg DAB 固體加到 20ml 0.01MPBS，臨用時(shí)加 100-200 微升30%雙氧水，注意避光。

7. 顯色 10min，看片子染色深淺情況適當(dāng)調(diào)整顯色時(shí)間。一般 3 分鐘顯色就比較明顯，如果 20 分鐘仍未顯色，則看下面的參考。

8. 然后 PBS 洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片，自然晾干。干燥天氣 2-3h，潮濕天氣 3-4h。

9. 脫水：70%酒精 3min，95%酒精 3min，100%酒精 3min，100%酒精 2min，二甲苯 2min，二甲苯 3-5min。如果片子上鹽分較多，在 70%酒精前在雙蒸水1min。

10. 將腦片放到 6 空板的山羊血清封閉液中，封閉 20-40min；（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用 PBS 洗一遍）

11. 吸去山羊血清，PBS 洗兩遍，將腦片周?chē)乃梦埢蛐l(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；

12. 然后按照一抗說(shuō)明書(shū)，將一抗按比例稀釋?zhuān)尤?PBS 稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50 微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30 微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；

13. 4℃，過(guò)夜（18h 或者 24h），不建議使用 37℃，如果熒光亮度不強(qiáng)，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間到 48 或 72 小時(shí)；

14. 然后，PBS 洗凈兩——三遍，按照二抗說(shuō)明書(shū)稀釋的熒光二抗，室溫孵育 2小時(shí)。注意避光操作。

15. 0.01M PBS 洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光自然晾干；

16. 滴加防淬滅劑后，蓋上蓋玻片鏡下觀察。

注意事項(xiàng)

1. 熒光太暗：可能蛋白表達(dá)少；可能一抗孵育時(shí)間短；二抗孵育時(shí)間短；清洗次數(shù)過(guò)多；溶液 pH 不合適；熒光萃滅；一抗?jié)舛冗^(guò)低或過(guò)高；二抗?jié)舛冗^(guò)低或過(guò)高；激發(fā)波長(zhǎng)不在抗體適用波段。

2. 背景熒光太深：一抗?jié)舛冗^(guò)高，清洗不徹底；二抗?jié)舛冗^(guò)高，清洗不徹底；封閉時(shí)間過(guò)短，非特異性過(guò)強(qiáng)；一抗非特異性過(guò)強(qiáng)；二抗非特異性過(guò)強(qiáng)；顯微鏡熒光強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)。