表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢測

一、MTT比色法檢測細(xì)胞活性

（一）原理
活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無色的MTT形成藍(lán)色的甲肷，其形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。對細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測可以通過MTT比色法進(jìn)行。

（二）試劑準(zhǔn)備
1、青鏈霉素溶液（100X）：青霉素100萬U，鏈霉素100萬U，溶于100mlddH2O中, 抽濾除菌。
2、L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1000mlL15培養(yǎng)基，加2g碳酸氫鈉，10ml 100X青鏈霉素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶于L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
4、SDS處理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加雙蒸水50ml溶解。
5、L-多聚賴氨酸：50μg溶于1ml雙蒸水中。
6、L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的不同濃度的蛋白液。

（三）操作步驟（以背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)為例）
1、無菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）。
2、鏡下去除神經(jīng)根和外膜，放入1ml 0.1%膠原酶中37℃消化30min，每5min搖勻一次。
3、洗去膠原酶，吹打分散后，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔含100μl無血清L15培養(yǎng)基，細(xì)胞約800個(gè)。
4、實(shí)驗(yàn)組分別加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對照加入等體積表達(dá)蛋白的溶劑。
5、37℃ 5%CO2培養(yǎng)48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS處理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶標(biāo)儀測定OD570值，數(shù)據(jù)分析。

二、DRG無血清培養(yǎng)檢測促神經(jīng)生長作用

（一）操作步驟：
1、無菌條件下取新生一天的SD大鼠DRG。
2、鏡下去除神經(jīng)根和外膜，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔1個(gè)DRG。
3、待DRG貼壁后加入100μl無血清L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對照加入等體積的溶解表達(dá)蛋白的溶劑。
4、37℃ 5%CO2培養(yǎng)，每天在Olympus倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，并進(jìn)行測量，其數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。

二、注意事項(xiàng)
1、MTT有毒，注意防護(hù)。
2、單個(gè)DRG貼壁實(shí)驗(yàn)操作難度較大，需仔細(xì)耐心。