瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA及RNA的純度及濃度

1、DNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測

（1）配制瓊脂糖凝膠

①稱取適量瓊脂糖，放入100mL錐形瓶中按膠濃度加入1倍 TAE 或 TBE 緩沖液，于微波爐或水浴中溶解。

②熔化的瓊脂糖冷卻至60℃，加入終濃度為0.5μg/mL 的 EB，混勻。

③將凝膠床水平放置，插入兩端的擋板，用滴管吸取少量的凝膠封好膠床邊緣。

④放入梳子，使梳齒高于底板0.5～1.0mm。

⑤倒入瓊脂糖凝膠溶液，其厚度為3～5mm，放置30～60min，使膠完全硬化。

⑥去掉兩端的擋板，將膠床放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，液面高出膠面1～2mm 小心拔出梳子，檢查樣品孔是否完整。

（2）點(diǎn)樣

①取濃度為 1μg/μL 的 DNA 樣品5μL，與 5μL 溴酚藍(lán)于封口膜上混合。

②用 20μL 的移液器將樣品加入樣品孔內(nèi)。操作時，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撐桌面，防止點(diǎn)樣時右手晃動。

③同樣操作點(diǎn)上 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物。

（3）電泳

將電泳槽置冰箱或冷室中，蓋上電泳槽蓋，接通電源，樣品端接負(fù)極（DNA 向陽極移動），以 5V/cm 電壓電泳。

（4）溴酚藍(lán)泳動至膠3/4距離時，可停止電泳，取出凝膠，置短波紫外線（254nm）下觀察。植物 DNA 樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶，與分子量標(biāo)準(zhǔn)物的遷移率相比大致估計所提 DNA 的相對分子質(zhì)量大小。

DNA 樣品純度植物總（核）DNA 樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶，質(zhì)粒 DNA 應(yīng)呈現(xiàn)三條不同構(gòu)型的條帶，這時表明所提樣品較純。如果在溴酚藍(lán)前有彌散的熒光區(qū)出現(xiàn)，則表明樣品中存有 RNA 雜質(zhì)，若所提總 DNA 或核 DNA 在0.5％瓊脂糖凝膠上不能形成清晰的條帶，而只是彌散一片，則表明 DNA 已嚴(yán)重降解。若所提質(zhì)粒 DNA 樣品在質(zhì)粒條帶上端還有熒光條帶（遷移率小于質(zhì)粒 DNA 條帶），表明質(zhì)粒 DNA 樣品中有染色體DNA 污染。

DNA 分子大小與泳動距離相同的標(biāo)準(zhǔn) DNA 條帶的相對分子質(zhì)量相近。

DNA 樣品量比較被測 DNA 樣品條帶與標(biāo)準(zhǔn) DNA 樣品條帶的熒光強(qiáng)度，DNA 量相同時所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度相同。如以 λ-DNA 為標(biāo)準(zhǔn)樣品，其濃度為1μg/μL，上樣量為 2μL，植物總 DNA 樣品條帶的亮度與之相近時，其電泳樣品量約為2g，根據(jù)上樣體積可大致估計出樣品 DNA 的濃度。對于 λ-DNA 限制性酶切片段的量可將總上樣量（xμg）除以總 bp數(shù)（約50000bp）再乘上該條帶的bp數(shù)。

（說明：①配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的 DNA 分子大小來確定。檢測植物總 DNA、核 DNA 時，使用0.5％的凝膠；檢測大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 時，使用0.8％～1.0％的凝膠。

②制備0.5％以下低濃度凝膠時，可先于膠床上制1％的支持膠，待其固化后將低濃度的膠制于其上，以增加凝固強(qiáng)度；

③若所提總 DNA 或核 DNA 在0.5％瓊脂糖凝膠上不能形成清晰的條帶，而只是彌散一片，則表明 DNA 已嚴(yán)重降解；

④需要快速檢測所提的 DNA 樣品時，可采用微型瓊脂糖凝膠電泳，配制1％的瓊脂糖凝膠10mL，倒在小玻璃板或幻燈片上，自然鋪開。梳子用 1mm 厚的有機(jī)玻璃制作，齒寬3mm，齒長5mm，齒間距為21nm。點(diǎn)樣量為2～5μL，6～7V/cm電壓電泳1h檢測。

⑤以 λ-DNA 限制性酶切片段為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

2、RNA 的變性瓊脂糖凝膠檢測

（1）試劑

①M(fèi)OPS 緩沖液（10倍）：0.4mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0），0.1mol/L NaAc，10mol/L EDTA。

②上樣染料：50％甘油，1mmol/L EDTA，0.4％溴酚藍(lán)，0.4％二甲苯藍(lán)。

③甲醛。

④甲酰胺（去離子）。

（2）操作

①將制膠用具用70％乙醇沖洗一遍，晾干備用。

②配制瓊脂糖凝膠

a.稱取 0.5g 瓊脂糖，置于干凈的 100mL 錐形瓶中，加入 40mL 蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。

b.待膠涼至60～70℃，依次向其中加入9mL甲醛、5mL MOPS 緩沖液（10倍）和 0.5μL 溴化乙錠，混合均勻。

c.灌制瓊脂糖凝膠。

③樣品準(zhǔn)備

a.取 DEPC 處理過的 500μL 離心管，依次加入如下試劑：MOPS 緩沖液（10倍）2μL，甲醛3.5μL，甲酰胺（去離子）10μL，RNA 樣品4.5μL，混勻。

b.將離心管置于60℃水浴中保溫10min，再置冰上2min。

c.向管中加入 3μL 上樣染料，混勻。

④上樣（注意點(diǎn)上 RNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物）。

⑤電泳：電泳槽內(nèi)加入1倍 MOPS 緩沖液，于 7.5V/mL 的電壓下電泳。

⑥電泳結(jié)束后，在紫外燈下檢查結(jié)果。

RNA 樣品質(zhì)量不管是變性凝放電泳還是非變性凝膠電泳，完整的總 RNA 樣品應(yīng)呈現(xiàn)出三條條帶，為 28SrRNA，18SrRNA，5 SrRNA。其中 8SrRNA 條帶的亮度應(yīng)約為18SrRNA 8條帶亮度的兩倍，表明 RNA 樣品比較完整，無多少降解。如果兩條帶的亮度反過來了，說明 28SrRNA 已降解成 18S 大小。如無清晰條帶，表明樣品已嚴(yán)重降解。如果在點(diǎn)樣槽內(nèi)或槽附近有熒光區(qū)帶，則表明 RNA 樣品中有 DNA 污染。

（3）說明

①RNA 電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0％～1.4％的凝膠，不同的RNA 條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA 的泳動率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定 RNA 分子量時，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總 RNA 樣品完整性時，配制普通的1％瓊脂糖凝膠即可。

②植物總 RNA 中的 28SrRNA 及 18SrRNA 在變性凝膠上的遷移率相當(dāng)于分子量 5.1kb 及2.0kbRNA 的遷移率。