遠(yuǎn)慕分享：RT-PCR的定義與檢測方法

1.定義：是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的RNA模板。

RNA擴(kuò)增包括兩個(gè)步驟： 在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)cDNA；加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA， 最后擴(kuò)增靶DNA。 2.檢測方法

⑴一步法：

利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢

測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。

⑵兩步法：

由于單管反應(yīng)時(shí)RT和PCR都不能在最佳條件下進(jìn)行并且 容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。