直接免疫熒光法和間接免疫熒光法簡介

免疫熒光技術(shù)是將熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)與相應(yīng)抗體（或抗原）以化學的方法結(jié)合，將熒光標記抗體（或抗原）與標本中相應(yīng)的抗原結(jié)合形成熒光標記的抗體- 抗原復(fù)合物，用熒光顯微鏡觀察。在鏡下見到有熒光存在即推斷有抗原抗體復(fù)合物的存在，根據(jù)已知的抗體（或抗原）即可推知另一個未知抗原（或抗體）的存在。
1. 直接免疫熒光法

直接免疫熒光法是利用熒光色素標記的特異性抗體直接與相應(yīng)的抗原結(jié)合，以鑒定未知抗原。本法具有操作簡單、時程短、特異性高的優(yōu)點，但也 存在缺點如不能檢查抗體，敏感性較差。

（1）在標本上滴加熒光素標記抗體，放入濕盒中。37℃溫育30min。

（2）PBS 沖洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。

（3）PBS浸泡1～2min，風干。

（4）緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察。

進行直接免疫熒光法時應(yīng)注意：①溫育時一定要將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。②用PBS浸泡時應(yīng)不斷振蕩。

2. 間接免疫熒光法

間接免疫熒光法以熒光素標記抗球蛋白抗體，抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，熒光標記的抗球蛋白抗體與已結(jié)合的抗體發(fā)生作用，從而推知抗原或抗體的 存在。間接熒光技術(shù)可以用已知的抗原檢測未知的抗體，也可用已知的抗體測出未知抗原?，F(xiàn)以檢測流行性出血熱病毒抗體（IgM）為例介紹如下：

（1）將待測病人血清加至抗原片（流行性出血熱病毒感染的Vero-E6細胞片）上，每個稀釋 度加2孔，最后2孔加PBS做對照。將玻片放置濕盒中，37℃溫育 60min。取出玻片，棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌5min，風干。

（2）加入1∶40稀釋的FITC標記的羊抗人IgM，37℃溫育60min。取出玻片，按步驟2洗滌，風干。

（3）PBS甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。陽性結(jié)果：在細胞膜及細胞質(zhì)中可見顆粒狀熒光顆粒，細胞核 呈紅色。

注意事項：溫育時將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。選擇低溫、干燥、潔凈的環(huán)境風干。