冷凍樣本真的不適合做單細(xì)胞測(cè)序嗎？

“單細(xì)胞測(cè)序”可以說(shuō)是這幾年的一個(gè)熱門詞匯，越來(lái)越多的研究者在自己的研究中用到這項(xiàng)技術(shù)，大家都知道目前單細(xì)胞測(cè)序不管是哪個(gè)平臺(tái)，基本還是需要新鮮的活體組織樣本，這對(duì)于很多研究者來(lái)說(shuō)是難以做到的，雖然目前也有單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)來(lái)解決新鮮組織難以獲取，或者是一些特殊組織樣本難以用活細(xì)胞上機(jī)的困境，但是很多老師還是擔(dān)心：冷凍樣本會(huì)不會(huì)不適合單細(xì)胞測(cè)序呢？冷凍樣本獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量會(huì)不會(huì)不如新鮮樣本呢？ 真相來(lái)了，最新的文章研究表明：人類癌癥樣本的冷凍保存可保留腫瘤異質(zhì)性，用于單細(xì)胞多組學(xué)分析。

高通量單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）已經(jīng)成為探索復(fù)雜人類癌癥中細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。使用新鮮手術(shù)組織樣本進(jìn)行scRNA-Seq研究，不可能對(duì)樣本進(jìn)行組織病理學(xué)分類，并限制了進(jìn)行批量處理的能力。在整合病人數(shù)據(jù)集時(shí)，這種阻礙往往會(huì)帶來(lái)技術(shù)上的偏差，并增加實(shí)驗(yàn)成本。雖然之前已經(jīng)探索了組織保存方法來(lái)解決此類問(wèn)題，但在復(fù)雜的人體組織上（如實(shí)體癌）和高通量scRNA-Seq平臺(tái)上，它還沒(méi)有被研究。

利用Chromium 10X平臺(tái)，對(duì)來(lái)自三個(gè)原發(fā)性乳腺癌、兩個(gè)原發(fā)性前列腺癌和一個(gè)皮膚黑色素瘤的新鮮和低溫保存的復(fù)制品共約12萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序。

三個(gè)原發(fā)性乳腺癌、兩個(gè)原發(fā)性前列腺癌和一個(gè)皮膚黑色素瘤樣本，首先將新鮮的手術(shù)標(biāo)本切成1-2mm3的小塊并充分混合，其中1/3立即用DMSO在-80℃下冷凍保存，命名為Cryoprerved Tissue（CT），剩下的2/3立刻用成熟的方法解離成單細(xì)胞懸液，其中一半單細(xì)胞懸液用DMSO在-80℃下冷凍保存，命名為cryopreserved cell suspension（CCS），剩下的一半單細(xì)胞懸液立即用10x平臺(tái)進(jìn)行scRNA-seq，命名為fresh tissue（FT）。

低溫保存的樣品，包括CT和CCS，在-80℃下儲(chǔ)存約1周后，在-196℃的液氮中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)5周，以模仿標(biāo)準(zhǔn)的組織生物庫(kù)程序。低溫保存后，CT和CCS樣本被解凍，并以與FT樣本相同的方式進(jìn)行scRNA-Seq處理。

分別對(duì)來(lái)自乳腺癌患者1-3期（BC-P1、BC-P2和BC-P3），不同處理方式FT、CCS或CT的樣本進(jìn)行了詳細(xì)的比較，這三種保存方式呈現(xiàn)出一致的 “可混合性”和強(qiáng)烈的重疊性。

研究發(fā)現(xiàn)，所有乳腺腫瘤集群中三種保存條件下的細(xì)胞均勻分布一致，通過(guò)分析典型細(xì)胞類型標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低溫保存的樣本中，主要細(xì)胞系得到了強(qiáng)有力的保存。

基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組的完整性是否在低溫保存過(guò)程中受到影響，首先檢查了每個(gè)細(xì)胞在低溫保存復(fù)制中檢測(cè)到的基因和獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符（UMI）的數(shù)量，M-P1（來(lái)自CCS和CO）與FT相比，每個(gè)細(xì)胞的平均基因數(shù)和UMI數(shù)較低。同樣，只有一個(gè)BC-P1樣本CT與FT相比，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因和UMI數(shù)量明顯較低。

接下來(lái)調(diào)查了FT樣品和低溫保存樣品之間的基因相關(guān)性，聚類相關(guān)顯示出與比較一致的趨勢(shì)，其中CCS樣本顯示出比FT樣本略高的R2相關(guān)性；

這些數(shù)據(jù)表明CCS樣本的scRNA-Seq產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量略高于CT樣本的數(shù)據(jù)，低溫保存可以為scRNA-Seq保存高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組。

三種不同的樣本處理方式在所有癌癥病例中檢測(cè)到的總路徑有很好的重疊，在所有病例中，超過(guò)64%的所有FT路徑在兩個(gè)冷凍保存的樣本中被一致檢測(cè)到，重疊率最小為64%，最大為77%，雖然這可能反映了基因表達(dá)程序可能受到低溫保存過(guò)程的影響，但這些途徑大多是在不同的細(xì)胞類型中檢測(cè)到的，從低溫保存樣本中檢測(cè)到的GO路徑的高度一致性來(lái)看，認(rèn)為這些微小的差異可能是由于scRNA-Seq平臺(tái)的變化導(dǎo)致的，而不是低溫保存過(guò)程導(dǎo)致的。

使用15種典型細(xì)胞類型的標(biāo)記物對(duì)一個(gè)冷凍保存為CT的乳腺癌病例進(jìn)行了CITE-Seq。首先使用來(lái)自RNA表達(dá)的典型標(biāo)志物的組合來(lái)廣泛地注釋集群。通過(guò)CITE-Seq，能夠驗(yàn)證細(xì)胞類型注釋，顯示相應(yīng)細(xì)胞類型上典型標(biāo)志物的高度特異性抗體衍生標(biāo)簽（ADT）表達(dá)水平。該研究表明高質(zhì)量的CITE-Seq免疫分型數(shù)據(jù)可以從低溫保存的CT組織的細(xì)胞中產(chǎn)生。這種方法可用于從冷凍臨床組織中提取額外的有力的表型信息，有助于單細(xì)胞簇的注釋和臨床相關(guān)分子的檢測(cè)，如免疫檢查點(diǎn)。

結(jié)論

通過(guò)對(duì)三種不同條件下的細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)分析，以評(píng)估冷凍保存對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞質(zhì)量、聚類和基因本體識(shí)別的影響。此外，使用CITE-Seq對(duì)固體組織碎片冷凍保存的單個(gè)乳腺癌樣本進(jìn)行了單細(xì)胞免疫分型。從新鮮組織中發(fā)現(xiàn)的腫瘤異質(zhì)性在低溫保存的樣本中基本保持不變。結(jié)果表明，從低溫保存的組織或低溫保存的單細(xì)胞懸液得到的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)與從新鮮組織中得到的細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)相當(dāng)，而低溫保存的細(xì)胞懸液在基因表達(dá)方面顯示出比新鮮組織更高的相關(guān)性，說(shuō)明低溫保存對(duì)下游分析的結(jié)果（如生物途徑富集）的影響很小。對(duì)于一些腫瘤，與新鮮保存的組織相比，冷凍保存適度地增加了細(xì)胞應(yīng)激特征。此外，該研究證明了冷凍保存的全細(xì)胞對(duì)于使用CITE-Seq檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白的優(yōu)勢(shì)，而使用其他保存方法（如單核測(cè)序）是達(dá)不到這個(gè)效果的。該研究表明可行的人類癌癥樣本低溫保存為多組學(xué)分析提供了高質(zhì)量的單細(xì)胞。該研究為組織生物庫(kù)的新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)，以用于未來(lái)的臨床單細(xì)胞RNA測(cè)序研究。