提取RNA時如何去除DNA的污染？

提取RNA時如何去除DNA的污染的方法：

注意實驗室的標(biāo)準(zhǔn)化問題，注意污染的存在，同時嚴(yán)格按照說明書上的操作應(yīng)該沒有問題。發(fā)現(xiàn)DNA污染，用DNAse I 消化1小時，37度離心取上清的時候，一定要小心不要取到中間的膜和下面的液體。直接加NaOH溶液與提取液混合攪拌,然后離心就可以了.因為RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,離心后的上清液就不含有DNA了。 RNA提取步驟：

1. 勻漿處理：

① 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10%。

② 單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

③ 細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106 動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。

6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

8. 用75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。

9. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事項：

從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。

勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機(jī)，2600×g離心30-60分鐘。

預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：

肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細(xì)胞8-15μg，成纖維細(xì)胞5-7μg 。