遠(yuǎn)慕技術(shù)：蛋白的生物活性測定方法

結(jié)晶紫法活性測定
1、取對數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞，用0.25%胰酶（以無鈣鎂離子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH7.2）吹打細(xì)胞，使形成細(xì)胞懸液。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞數(shù)為2~2.5x105個(gè)/ml。接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100µl/孔。接種細(xì)胞時(shí)須不斷搖動(dòng)細(xì)胞懸液，以保證各孔細(xì)胞數(shù)的均勻一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，觀察到孔中細(xì)胞長滿70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培養(yǎng)基中加入放線菌素D，使終濃度為1.5µg/ml，配成樣品稀釋液。取此稀釋液900µl至Eppendorf管中，另在9個(gè)5ml管中加入700µl稀釋液。
3、用完全培養(yǎng)基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品（上海恰爾生物技術(shù)有限公司研制，批號(hào)：0304，凍干粉劑，蛋白濃度：2mg/支）復(fù)溶至1000µl（液體樣品測定蛋白濃度后，直接進(jìn)行下一步操作），取出100µl至已裝有900µl稀釋液的Eppendorf管中，充分混勻，盡量不起泡沫。再從此管中吸出100µl至下一管中，如此反復(fù)n次（即測定前10倍稀釋若干次，直到與估計(jì)活性相接近時(shí)）。
4、從最后稀釋的Eppendorf管中吸出700µl樣品至已裝有700µl稀釋液的5ml管中，充分混勻。再從此管中吸出700µl至下一管同樣裝有700µl稀釋液的5ml管中，如此反復(fù)9次（即測定時(shí)倍比稀釋樣品）。
5、棄去96孔板中舊的培養(yǎng)基，從第一個(gè)5ml管中吸取已稀釋的樣品100µl至第2排細(xì)胞孔中，每個(gè)稀釋度作6復(fù)孔(n=6)；從第二個(gè)5ml管中吸取的樣品加入第3排細(xì)胞中，依此類推，直至第10排孔結(jié)束。第1排中不含細(xì)胞，加入100µl/孔含有放線菌素D的稀釋液作空白對照；第11排加100µl/孔稀釋液作細(xì)胞對照；第12排加不含放線菌素D的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。
6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，初步判斷結(jié)果。
7、棄除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入100µl染色液（1.5mmol/L結(jié)晶紫）染色30min。洗去染色液，甩去水分并在吸水紙上拍打以使干燥。沖洗程度以在吸水紙上拍打時(shí)，沒有顏色出現(xiàn)為宜。
8、充分干燥后，每孔加入100µl33%濃度的冰醋酸，在振蕩儀上充分振蕩使結(jié)晶溶解。設(shè)定λ=595nm酶聯(lián)檢測儀測定各孔的吸光值，據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算出對細(xì)胞50%殺傷時(shí)所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。

[活性計(jì)算]
活性單位定義：在上述測定條件下，以50%SW1990腫瘤細(xì)胞被殺傷時(shí)，為基因工程人腫瘤凋亡素的1個(gè)活性單位。
1、樣品的稀釋度取常用對數(shù)。
2、根據(jù)對應(yīng)的細(xì)胞毒活性（光密度值）與稀釋度的對數(shù)，進(jìn)行線性回歸，得到計(jì)算公式y(tǒng)=ax+b，分析相關(guān)系數(shù)R值，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求者進(jìn)行下一步分析。
3、代入50%殺傷時(shí)的光密度值（即第11排細(xì)胞光密度值的一半），計(jì)算出稀釋倍數(shù)的對數(shù)，再求出稀釋倍數(shù)。
4、根據(jù)原樣品濃度及稀釋倍數(shù)計(jì)算出基因工程人腫瘤凋亡素對細(xì)胞50%殺傷時(shí)的濃度，再算出比活性。
5、其他細(xì)胞的檢測方法同上，計(jì)算時(shí)根據(jù)對SW1990標(biāo)定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單位，先求出對細(xì)胞50%殺傷時(shí)的所需活性單位，再根據(jù)基因工程人腫瘤凋亡素對SW1990細(xì)胞殺傷的比活性算出相應(yīng)的絕對量。

[計(jì)算結(jié)果]
0304批原液：比活為：1.03×107活性單位/mg

蛋白的生物活性及結(jié)構(gòu)測定方法
生物活性測定[37,38]是將人胰腺癌1990細(xì)胞以2×105個(gè)/ml種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6小時(shí)，用完全培養(yǎng)液（加有1.2µg/m的放線菌素D）做梯度稀釋的樣品加入細(xì)胞板（n=3）。置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱，18h后棄上清，以結(jié)晶紫固定液（結(jié)晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%）染色15min，蒸餾水洗去結(jié)晶紫。每孔再加入200μ33%的乙酸，旋渦混勻，置酶聯(lián)儀讀出D（595）值，以未加細(xì)胞的空白孔為D本底。根據(jù)活性單位定義：使培養(yǎng)孔中的細(xì)胞50%死亡為一個(gè)單位。

MTT法——活性測定
1、 接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103-104 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。
2、 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)3-5天。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?br> 3、 呈色：培養(yǎng)第3-5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清。每孔加入150μlDMSO（二甲基亞砜），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。
4、 比色：選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定個(gè)孔吸收值，記錄結(jié)果。