植物根系活力檢測(cè)試劑盒(TTC比色法)實(shí)驗(yàn)方法

產(chǎn)品說(shuō)明：
植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和代謝水平即根系活力將直接影響植物地上部分的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況以及最終產(chǎn)量，是植物生長(zhǎng)的重要生理指標(biāo)之一，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是一種氧化還原物質(zhì)，是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶解于水為無(wú)色，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯基甲腙(TTF)，TTF比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC常被用作酶試驗(yàn)的氫受體。

植物根系活力檢測(cè)試劑盒(TTC比色法)，又稱作植物根系脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)原理是當(dāng)測(cè)定植物根系活力時(shí)，以TTC為底物，保溫1~4小時(shí)，根系中脫氫酶能夠還原TTC并生成不溶于水的紅色TTF，再用有機(jī)溶劑(乙酸乙酯或丙酮等)將其從根中提取出來(lái)，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)485nm處吸光度，進(jìn)而計(jì)算出TTC的還原量，以該還原量表示脫氫酶活性，并作為植物根系活力的指標(biāo)，該試劑盒主要用于定量測(cè)定植物的根系活力或脫氫酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：
試劑(A):TTC    1g    RT避光
試劑(B):TTCAssayBuffer    250ml    RT
試劑(C):TTC終止液    100ml    RT
試劑(D):Na2S2O4粉末    0.1g    RT
使用說(shuō)明書(shū)    1份

自備材料：
1、蒸餾水、乙酸乙酯
2、離心管或容量瓶、濾紙
3、恒溫箱或水浴鍋、研缽或勻漿器
4、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀、比色杯或96孔板

操作步驟(僅供參考)：

1、配制TTC溶液(0.4%)：稱取0.4gTTC完全溶解于100ml蒸餾水即成，配制成溶液后應(yīng)4℃避光保存，若變紅應(yīng)棄用。

2、配制TTCAssayBuffer工作液：將TTC溶液(0.4%)與TTCAssayBuffer等比例混合即成，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃避光保存，若變紅應(yīng)棄用。

3、配制TTF標(biāo)準(zhǔn)工作液：取0.25mlTTC溶液(0.4%)置于10ml離心管或容量瓶，加入少許Na2S2O4粉末(一般2mg左右)，混勻，產(chǎn)生紅色的不溶于水的紅色顆粒物TTF，加10ml乙酸乙酯，充分混合溶解顆粒，靜置分層(下層0.25ml為無(wú)色水層，不可用)，上層紅色溶液中TTF濃度為100μg/ml。

按下表分別移取上層紅色溶液0.25、0.5、1、1.5、2ml置于離心管或容量瓶中，用乙酸乙酯補(bǔ)加至10ml，即獲得TTF系列標(biāo)準(zhǔn)管。

加入物(ml)    0    1    2    3    4    5
TTF標(biāo)準(zhǔn)工作液    0    0.25    0.5    1    1.5    2
乙酸乙酯    10    9.75    9.5    9    8.5    8
相當(dāng)于TTF含量(μg)    0    25    50    100    150    200

4、準(zhǔn)備樣品：取0.2~0.5g植物須根系，洗凈，用濾紙吸干，完全浸沒(méi)于TTCAssaybuffer工作液中，37℃避光孵育1~3h，加入2mlTTC終止液終止反應(yīng)；同時(shí)做一空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即根系先完全浸沒(méi)于2mlTTC終止液以殺死根樣，再加入10mlTTCAssayBuffer工作液，37℃避光孵育1~3h。
5、提?。悍謩e將上述實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的根系取出，濾紙吸干水分，放入研缽或勻漿器中，加入3~4ml乙酸乙酯，充分研磨或勻漿，以提取出TTF，把紅色提取液(TTF)轉(zhuǎn)移至離心管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈?~3次，再將洗滌液一并轉(zhuǎn)移至離心管，最后補(bǔ)加乙酸乙酯至10ml，搖勻。

6、測(cè)定：比色杯光徑1.0cm，系列標(biāo)準(zhǔn)管以“0”號(hào)管調(diào)零，測(cè)定1~5號(hào)管485nm的吸光度值；樣品管以空白對(duì)照組樣品提取液做參比，調(diào)零，以分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組樣品提取液在485nm的吸光度值。

計(jì)算：
以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液TTF含量(25、50、100、150、200μg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制TTF標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品的TTF含量或TTC還原量(μg)，即為根系活力或脫氫酶活性。

根系(脫氫酶)活力[mg/(g·h)]=m/(1000×W×t)
式中：m=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品提取液TTF含量(μg)=TTC還原量(μg)
W=植物須根系的重量(g)
t=孵育時(shí)間(h)

注意事項(xiàng)：
1、配制好的TTC溶液(0.4%)和TTCAssaybuffer工作液應(yīng)避光保存，若變紅應(yīng)棄用。
2、根系種類不同，取樣量可有不同。
3、根系應(yīng)吸干水分但不能擠壓傷及細(xì)胞，才能測(cè)定準(zhǔn)確。
4、提取用的研缽或勻漿器、試管、比色皿均應(yīng)保持干燥，沒(méi)有水分。
5、由于本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑(乙酸乙酯或丙酮)提取TTF，因此不能用一次性塑料比色皿或者酶標(biāo)條進(jìn)行檢測(cè)；建議用石英比色皿或玻璃比色皿檢測(cè)，檢測(cè)完成后用乙醇清洗并用水沖洗干燥即可。
6、如果沒(méi)有分光光度計(jì)，也可以使用酶標(biāo)儀測(cè)定，但應(yīng)注意酶標(biāo)板每孔檢測(cè)體積。
7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

注意：由于檢測(cè)儀器和操作手法等條件的不同，參考值范圍會(huì)有波動(dòng)，該值僅供參考，對(duì)于要求精確計(jì)算植物根系含量的，可以采用標(biāo)準(zhǔn)曲線多點(diǎn)重復(fù)測(cè)定；根據(jù)測(cè)定經(jīng)驗(yàn)顯示，TTF含量在5μg以下，400μg以上，標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)有偏差。

有效期：12個(gè)月有效。