使目的基因穩(wěn)定表達為啥要借助質(zhì)粒？

（1）轉(zhuǎn)化是指目的基因進人受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程

（2）①啟動子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)．

②tms基因能夠編碼生長素，tmr基因能夠編碼細胞分裂素，這兩種激素能夠促進植物的生長．因此人工改造時用限制酶Ⅰ處理，其目的之一是除去或破壞質(zhì)粒上的tmr、tms，保證T-DNA進入水稻細胞后不會引起細胞的無限分裂和生長；另外只有一個插入位點，也有利于目的基因（或外源DNA）準確插入．

③若用限制酶Ⅱ切割改造過的理想質(zhì)粒，質(zhì)粒上的抗四環(huán)素的標記基因（tet）就會破壞，所以以含四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在含卡那霉素的培養(yǎng)基能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長．

故答案為：

（1）轉(zhuǎn)化

（2）①啟動子

②tms和tmr 目的基因（或外源DNA）準確插入

③在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長

質(zhì)粒如何提取？

1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

具體操作步驟：

將1u質(zhì)粒DNA加入1.5ml的離心管；

將感受態(tài)細菌（competent cells）從－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受態(tài)細菌，加入含質(zhì)粒DNA的1.5ml的離心管；

輕輕地旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30～60 min；

42度熱休克90s（該時間應該非常準確，用Timer記時），冰上放置5min；

每管加500uLB培養(yǎng)液，放37℃水浴1h；

吸取200ul培養(yǎng)物至含相應抗生素的90mm LB平板上，涂布棒將培養(yǎng)液涂布均勻；

倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。

2. 質(zhì)粒的抽提

具體操作步驟：

用前將RNase A管的液體全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般儲存在4℃）；

將60ml的乙醇加到洗滌緩沖液瓶

37℃培養(yǎng)16h的平板中挑取一個單菌落（直徑2～3mm），接種到10mLB培養(yǎng)液 37℃劇烈振搖培養(yǎng)16 h；

取4ml菌液到5m離心管，8000rpm室溫離心3min；

去上清，放于面巾紙上吸干痕液，

加250 uSolution Ⅰ（注意用前應該加RNase A管），于渦旋振蕩器重懸細胞；

加250 u37℃預熱2-3min的Solution Ⅱ；

加350 uSolution Ⅲ，將5ml離心管置于拇指和食指間柔和地反復顛倒數(shù)次；

將5ml離心管中的溶液倒入1.5m離心管中，

室溫孵育2-3min，12000rpm 4℃離心15 min；

裝配2m收集管（白色）和柱狀收集管（藍色）

將上清倒入柱狀收集管（藍色）中；

8000rpm室溫離心3min；

去掉收集管中的液體，加500uBuffer HB 到柱狀收集管中，10000rpm室溫離心1min；

去掉柱狀收集管中的液體，加750uWash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室溫離心1min；

重復上述步驟一次；

不加Wash Buffer將管子10000rpm室溫離心1min；

將柱狀管放到一個消過毒的1.5m離心管中，加65ul滅菌水，室溫放置2min，8000rpm室溫離心3min 洗提（洗脫）DNA。

3. 質(zhì)粒電泳

具體操作步驟（以倒20ml的膠為例）：

用50ml量筒量取20m1XTAE；

用電子天平稱量0.16g瓊脂糖，并倒入20ml電泳緩沖液中；

將稱量紙覆蓋在裝有瓊脂糖的電泳緩沖液的三角瓶中，放入微波爐中轉(zhuǎn)1min30s，至肉眼看不到顆粒狀瓊脂為止；

至室溫待溶液冷卻至60度左右，將三角瓶中溶液倒入制膠盒中，并加入上樣梳子；

至室溫約30min膠凝固后，拔掉梳子并將凝膠安放到電泳槽內(nèi)；

向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm；

將樣品中加入適量的10X上樣緩沖液，該上樣緩沖液的體積計算如下：如果樣品體積是20ul加入2u10X上樣緩沖液，如果是30ul，加入3u10X上樣緩沖液；

將樣品加入上樣槽中，打開電源，一般為120v，電泳約20-30min，關掉電源，在Dark Reader熒光透射儀觀察結(jié)果。