使目的基因穩(wěn)定表達(dá)為啥要借助質(zhì)粒？

（1）轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)人受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程

（2）①啟動(dòng)子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)．

②tms基因能夠編碼生長(zhǎng)素，tmr基因能夠編碼細(xì)胞分裂素，這兩種激素能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)．因此人工改造時(shí)用限制酶Ⅰ處理，其目的之一是除去或破壞質(zhì)粒上的tmr、tms，保證T-DNA進(jìn)入水稻細(xì)胞后不會(huì)引起細(xì)胞的無限分裂和生長(zhǎng)；另外只有一個(gè)插入位點(diǎn)，也有利于目的基因（或外源DNA）準(zhǔn)確插入．

③若用限制酶Ⅱ切割改造過的理想質(zhì)粒，質(zhì)粒上的抗四環(huán)素的標(biāo)記基因（tet）就會(huì)破壞，所以以含四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在含卡那霉素的培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)．

故答案為：

（1）轉(zhuǎn)化

（2）①啟動(dòng)子

②tms和tmr 目的基因（或外源DNA）準(zhǔn)確插入

③在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)

質(zhì)粒如何提??？

1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

具體操作步驟：

將1u質(zhì)粒DNA加入1.5ml的離心管；

將感受態(tài)細(xì)菌（competent cells）從－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受態(tài)細(xì)菌，加入含質(zhì)粒DNA的1.5ml的離心管；

輕輕地旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30～60 min；

42度熱休克90s（該時(shí)間應(yīng)該非常準(zhǔn)確，用Timer記時(shí)），冰上放置5min；

每管加500uLB培養(yǎng)液，放37℃水浴1h；

吸取200ul培養(yǎng)物至含相應(yīng)抗生素的90mm LB平板上，涂布棒將培養(yǎng)液涂布均勻；

倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。

2. 質(zhì)粒的抽提

具體操作步驟：

用前將RNase A管的液體全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般儲(chǔ)存在4℃）；

將60ml的乙醇加到洗滌緩沖液瓶

37℃培養(yǎng)16h的平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑2～3mm），接種到10mLB培養(yǎng)液 37℃劇烈振搖培養(yǎng)16 h；

取4ml菌液到5m離心管，8000rpm室溫離心3min；

去上清，放于面巾紙上吸干痕液，

加250 uSolution Ⅰ（注意用前應(yīng)該加RNase A管），于渦旋振蕩器重懸細(xì)胞；

加250 u37℃預(yù)熱2-3min的Solution Ⅱ；

加350 uSolution Ⅲ，將5ml離心管置于拇指和食指間柔和地反復(fù)顛倒數(shù)次；

將5ml離心管中的溶液倒入1.5m離心管中，

室溫孵育2-3min，12000rpm 4℃離心15 min；

裝配2m收集管（白色）和柱狀收集管（藍(lán)色）

將上清倒入柱狀收集管（藍(lán)色）中；

8000rpm室溫離心3min；

去掉收集管中的液體，加500uBuffer HB 到柱狀收集管中，10000rpm室溫離心1min；

去掉柱狀收集管中的液體，加750uWash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室溫離心1min；

重復(fù)上述步驟一次；

不加Wash Buffer將管子10000rpm室溫離心1min；

將柱狀管放到一個(gè)消過毒的1.5m離心管中，加65ul滅菌水，室溫放置2min，8000rpm室溫離心3min 洗提（洗脫）DNA。

3. 質(zhì)粒電泳

具體操作步驟（以倒20ml的膠為例）：

用50ml量筒量取20m1XTAE；

用電子天平稱量0.16g瓊脂糖，并倒入20ml電泳緩沖液中；

將稱量紙覆蓋在裝有瓊脂糖的電泳緩沖液的三角瓶中，放入微波爐中轉(zhuǎn)1min30s，至肉眼看不到顆粒狀瓊脂為止；

至室溫待溶液冷卻至60度左右，將三角瓶中溶液倒入制膠盒中，并加入上樣梳子；

至室溫約30min膠凝固后，拔掉梳子并將凝膠安放到電泳槽內(nèi)；

向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm；

將樣品中加入適量的10X上樣緩沖液，該上樣緩沖液的體積計(jì)算如下：如果樣品體積是20ul加入2u10X上樣緩沖液，如果是30ul，加入3u10X上樣緩沖液；

將樣品加入上樣槽中，打開電源，一般為120v，電泳約20-30min，關(guān)掉電源，在Dark Reader熒光透射儀觀察結(jié)果。