質(zhì)粒中的內(nèi)毒素可能會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率！

轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專(zhuān)門(mén)技術(shù)。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類(lèi)途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法較為常用；生物介導(dǎo)方法現(xiàn)在比較多見(jiàn)的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。 什么是內(nèi)毒素？

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LipopolySaccharide,LPS）和蛋白的復(fù)合物，當(dāng)細(xì)菌裂解時(shí)便會(huì)大量釋放出來(lái)。內(nèi)毒素單位為EU。

內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)的影響

內(nèi)毒素存在極大程度地影響轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)內(nèi)毒素還可能激活免疫細(xì)胞的非特異反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)中的假陽(yáng)性。因此，為了保證高轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染細(xì)胞高存活率，必須從質(zhì)粒制備的過(guò)程中將內(nèi)毒素去除。

內(nèi)毒素和質(zhì)粒的關(guān)系

由于內(nèi)毒素兩親性和負(fù)電荷性，性質(zhì)類(lèi)似于DNA，因此在質(zhì)粒純化中會(huì)伴隨質(zhì)粒一同被純化出來(lái)。質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量的高低常用EU/?g質(zhì)粒表示。

按照EU/?g大小，質(zhì)粒被分為三個(gè)級(jí)別：測(cè)序級(jí)別（>50EU/?g）、轉(zhuǎn)染級(jí)別(<50EU/?g)和無(wú)內(nèi)毒素級(jí)別(<0.1EU/?g)。

內(nèi)毒素對(duì)于生物學(xué)應(yīng)用的影響

內(nèi)毒素會(huì)對(duì)原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染過(guò)程造成重要影響，內(nèi)毒素水平的升高會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的急劇下降。而且，使用不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA對(duì)于基因治療的相關(guān)應(yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)閮?nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱、內(nèi)毒素性休克綜合癥，并會(huì)在動(dòng)物和人體上激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)毒素也會(huì)干擾如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞一類(lèi)免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的非特異性激活。這些效應(yīng)還包括對(duì)如IL-1和前列腺素等免疫介質(zhì)的誘導(dǎo)性合成。為了避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤判斷，確保塑料制品、培養(yǎng)基、血清和質(zhì)粒DNA中均無(wú)LPS污染十分重要。

不同質(zhì)粒制備方法中的內(nèi)毒素污染

內(nèi)毒素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以及它們形成膠束結(jié)構(gòu)的傾向性，都使得它們?nèi)菀着c質(zhì)粒DNA共同被純化出來(lái)。例如，在CsCl超速離心法當(dāng)中，CsCl結(jié)合的DNA很容易被內(nèi)毒素分子所污染，因?yàn)樵贑sCl中內(nèi)毒素與質(zhì)?！寤义V復(fù)合物具有相似的密度。

在大尺寸DNA純化樹(shù)脂上，高分子量膠束樣內(nèi)毒素很類(lèi)似于高分子量的DNA分子；在陰離子交換色譜法當(dāng)中，內(nèi)毒素分子上的負(fù)電荷能夠與陰離子交換樹(shù)脂相互作用，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA被共同純化下來(lái)。不過(guò)，質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素污染的水平很大程度上依賴(lài)于所使用的純化方法。QIAGEN Plasmid Kit和2xCsCl梯度離心法均能夠生成較低內(nèi)毒素含量的高純度DNA。硅膠懸漿法純化出的DNA則含有顯著升高的內(nèi)毒素污染。使用EndoFree Plasmid Kit抽提出的DNA僅含有可忽略不計(jì)的微量?jī)?nèi)毒素（<0.1EU /ug質(zhì)粒DNA）。